Головна
Cоціологія || Гуманітарні науки || Мистецтво та мистецтвознавство || Історія || Медицина || Науки про Землю || Політологія || Право || Психологія || Навчальний процес || Філософія || Езотерика || Екологія || Економіка || Мови та мовознавство
ГоловнаМедицина → генетика
««   ЗМІСТ   »»

ГІБРИДИЗАЦІЯ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ

Реакцію гібридизації використовують в генетичної інженерії для створення гібридних молекул ДНК, а також як ефективний метод для виявлення певних послідовностей в ДНК і РНК. Якщо водний розчин ДНК нагріти до температури 96-100 ° С і сильно защелочіть (pH> 13,0), то ДНК дисоціює на окремі ланцюги. цей процес денатурації ДНК звернемо, оскільки якщо дві ізольовані ланцюга ДНК витримувати певний час при 65 ° С, то вони знову спаровуються, утворюючи подвійну спіраль, що і називають ренатурацією, або гибридизацией (відпалом). Гібридизація може йти між одинарними ланцюгами ДНК і / або РНК (звичайно, якщо вони мають комплементарні послідовності нуклеотидів), що призводить до утворення подвійних ланцюгів (дуплексів) різного складу: ДНК: ДНК; РНК: РНК; ДНК: РНК.

При конструюванні гібридних ДНК гібридизація нуклеїнових кислот реалізується як правило в двох основних стратегіях (методах) отримання рекомбінантних ДНК: коннекторние і рестріктазного-лігазну.

коннекторние метод (Рис. 15.2) створює умови для гібридизації продуктів рестрикції різних геномів шляхом нарощування на їх кінцях комплементарних олігонуклеотидних ділянок. Гібридизація (отжиг) цих ферментів веде до утворення гібридних молекул ДНК. У цьому методі використовують 3 ферменту: 5'-екзонуклеаза, термінальну нуклеотіділ- трансферазу і ДНК-лігази. Саме цим методом П. Берг і співробітники отримали в 1972 р першу гібридну молекулу ДНК.

Схема контрольного методу отримання гібридних молекул ДНК

Мал. 15.2. Схема контрольного методу отримання гібридних молекул ДНК

Рестріктазного-лігазну метод (Рис. 15.3) найбільш простий і популярний в генетичній інженерії. У цьому методі з використанням однієї рестріктази II, що дає фрагменти рестрикції з «липкими кінцями», гібридизація між фрагментами хромосомної ДНК і ДНК-плазмидой здійснюється без додаткової процедури нарощування комплементарних кінців. Після закінчення гібридизації залишається тільки зшити полі- нуклеотидні фрагменти за допомогою ДНК-лігази.

Схема рестріктазного-лігазну методу отримання гібридних молекул ДНК

Мал. 15.3. Схема рестріктазного-лігазну методу отримання гібридних молекул ДНК

Гібридизацію використовують для знаходження числа певних нуклеотидних послідовностей (генів) в ДНК. Для цієї мети застосовують ДНК -зонди - радіоактивні фрагменти ДНК з відомою нуклеотидної послідовністю. Мітку в зонд вводять шляхом нік-трансляції. Це дуже точний метод, який дозволяє виявити один ген в клітці. Так виявляють окремі (унікальні гени), а також гени, представлені в геномі десятками або сотнями копій.

Для локалізації специфічних послідовностей нуклеїнових кислот в хромосомах і клітинах використовують гібридизацію in situ. При цьому ДНК-зонди гибрідизуючою з хромосомами після короткочасного впливу лугом. Далі місця гібридизації виявляють за допомогою радиоавтографии. Застосовують не тільки радіоактивні, а й хімічно мічені ДНК-зонди. Для цього при синтезі зонда використовують нуклеотиди, що містять бічну ланцюг біотину, яку після гібридизації забарвлюють стрептовідіном. За допомогою гібридизації in situ можна виявити локалізацію певних видів мРНК в клітинах і таким чином судити про диференціювання в клітинах ембріона. Популярною біологічної моделлю таких досліджень є ембріони плодової мушки дрозофіли.

Гібридизацію використовують для виявлення транскрібіруемих і не- транскрібіруемих послідовностей в ДНК. При цьому аналізуються продукти гібридизації ДНК і матричних РНК, що дозволяє виявити активні (транскрібіруемих) ділянки в молекулах ДНК.

Гібридизація широко використовується для виявлення певних нуклеотидних послідовностей в суміші рестрикційних фрагментів. Такий прийом носить назву блот (Від англ, blot - промокати). Рестрикційні фрагменти фракционируют методом електрофорезу (застосовують високошвидкісне центрифугування в градієнті щільності CsCl з використанням етидія броміду). Це дозволяє розділити до 500 фрагментів, що відрізняються за розмірами всього на один нуклеотид. Потім гель агарозу поєднують з листом нітроцелюлозній паперу. В результаті дифузії фрагменти частково переходять на цей лист, і таким чином виходить відбиток (репліка) з гелю. Потім методом радиоавтографии з використанням радіоактивного ДНК-зонда визначають на репліці положення фрагментів, які гибрідизуючою з зондом.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - це метод ампліфікації (від лат. ampliticatio - поширення, збільшення) фрагментів нуклеїнових кислот in vitro. З його допомогою можна досить швидко отримати мільйони копій сегментів ДНК або РНК, навіть коли вони присутні в препараті у вигляді єдиної молекули.

Вся полімеразна ланцюгова реакція здійснюється in vitro з використанням ДНК-полімерази і олігонуклеотидних праймерів, комплементарних двом З'-кінців ділянок, що обмежують ампліфіціруемого двобічний сегмент. Для здійснення реакції необхідно знати нуклеотидну послідовність тієї ділянки, яка бажано ампліфікувати, щоб можна було синтезувати відповідні олігонуклеотидних праймери.

У методі ПЛР для ампліфікації фрагментів ДНК використовують термоустойчивую ДНК-полімерази з термофільної бактерії Thermus aquaticus (7ад-полімерази), яка в присутності всіх чотирьох видів нуклеотидів і коротких 20-30-членних запалів (праймерів) здійснює синтез комплементарних послідовностей ДНК.

Спочатку здійснюють термічну денатурацію (розплітання) двухцепочечной молекули (фрагмента) ДНК при 93-95 "С, що призводить до поділу комплементарних ланцюгів. Після цього проби охолоджують до 60 ° С, що дає можливість зв'язатися праймерів і одноланцюговим дезоксіоліго- нуклеотидам, а Гад-полімерази - включитися в роботу.

Праймери зазвичай отримують методом хімічного синтезу, визначивши попередньо нуклеотидную послідовність прикордонних з ампліфіціруемого геном ділянок ДНК. Праймери підлаштовуються самі (по комплементарному принципом) до денатурований нагріванням гомологічним ділянкам одноланцюгових фрагментів вихідної «материнської») ДНК. Вони служать, по суті, для двох цілей: по-перше, запускають роботу ДНК-полімерази, по-друге, обмежують її дію, як би застопорівают фермент в рамках потрібної ділянки копіювання ДНК.

ПЛР має циклічний характер (рис. 15.4). У першому і частково у другому циклах утворюються копії (амплікона) ДНК не відповідають кордонів амплифицируемого гена (всі амплікона в першому циклі і частина амплікон в другому циклі виходять більш протяжними в тих ділянках, де ще не відбулося зв'язування другого - «антисмислового» - праймера) . Однак починаючи вже з третього циклу довжина амплікон стає стандартною, т. Е. Відповідає числу пар нуклеотидів фрагментів ДНК-матриці між З'-кінцями праймерів. Амплікона накопичуються в геометричній прогресії і починають домінувати серед продуктів ампліфікації. Процес має ланцюговий характер, т. К. Синтезовані фрагменти ДНК в подальшому самі служать матрицею, на якій йде синтез.

Схема полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)

Мал. 15.4. Схема полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)

При багаторазовому повторенні циклів синтезу (що включають нагрівання та охолодження проб в вищеназваних межах температур) число копій специфічних фрагментів ДНК експоненціально збільшується. Це дозволяє з невеликого числа наявних фрагментів отримати безліч копій, які можна ідентифікувати методом електрофорезу. Повторюючи цикли ампліфікації 30-40 разів, за 1,5-3 год отримують мільйони копій фрагментів ДНК.

Результати, що досягаються за допомогою ПЛР, дозволили цим методом зайняти провідне місце в молекулярної біології як за популярністю використання в наукових дослідженнях фундаментального характеру, так і з практичного застосування в медичних цілях.

Дуже важливо застосування ПЛР при визначенні характеру мутацій. Після того як ген клонований, за допомогою двох праймерів ампліфіціру- ють відповідний геномної сегмент, отриманий від різних особин даного виду. Секвенування цього сегмента дозволяє встановити природу мутації, що сталася в даному гені, або виявити поліморфізм, будь то заміна однієї пари підстав або делеція, инсерция або перебудова. Завдяки простоті методу з його допомогою можна діагностувати генетичні захворювання і проводити популяційно-генетичні дослідження.

  1. Гормональна регуляція метаболізму триацилгліцеридів - біохімія людини
    Крім аллостерічеськой регуляції коферментами існує гормональний контроль активності ацетил-КоА-карбоксилази. Адреналін і глюкагон шляхом збільшення концентрації сАМР і активності протеїнкінази фосфорилируют ацетил-КоА-карбоксилазу і переводять її в неактивний стан. Ці гормони також
  2. Гонадотропні гормони - біохімія
    До гонадотропним відносяться фолликулостимулирующий (фоллітропін, ФСГ) і лютеїнізуючого (лютропін. Л Г) гормони. Обидва гормону є глікопротеїнами і являють собою димер, що складаються з а- і р-нерав- нозначних субодиниць. а-Субодиниці складаються з мало варіабільності від виду до виду 89-95
  3. Головний мозок. Стовбур мозку - анатомія центральної нервової системи
    В результаті вивчення даного розділу студент повинен: знати основні відділи головного мозку, їх взаємне розташування і основний поділ функцій; пов'язані з різними відділами головного мозку черепні нерви, їх сенсорні, рухові і вегетативні функції, а також розташування ядер; найбільш важливі
  4. Гнійна хірургічна інфекція, гнійна хірургічна інфекція - факультетська хірургія
    Після вивчення глави студент повинен: знати основні причини та патогенез розвитку септичного стану; відмінності між системним запальним синдромом і сепсисом; вміти попереджати системну відповідь на запалення; володіти методами діагностики гнійної хірургічної інфекції і сепсису. Гнійна хірургічна
  5. Гліцин - нервова система: анатомія, фізіологія, Нейрофармакологія
    гліцин - харчова амінокислота, яка є гальмівним медіатором, головним чином, в СМ і в стовбурі ГМ. Гліцин дуже важливий для забезпечення рефлекторної діяльності СМ і рухових ядер черепних нервів, забезпечуючи своєчасне гальмування мотонейронів через вставні гальмівні нейрони, звані клітинами
  6. Гліальні клітини - нервова система: анатомія, фізіологія, Нейрофармакологія
    До клітинам нервової тканини крім нейронів відносяться також гліальні клітини, які дуже різноманітні за будовою і виконуваних функцій. гліальні клітини - нейроглії, гліоціти - мають багато спільних рис з нейронами, зокрема для них характерна наявність великої кількості розгалужених відростків
  7. Гіпоталамус - анатомія центральної нервової системи
    гіпоталамус - подбугорная область проміжного мозку, вищий центр регуляції вегетативних і ендокринних функцій (рис. 8.3). Він об'єднує ряд структур, що оточують нижню частину III мозкового шлуночка - сірий бугор, маміллярних (сосковидні) тіла, зорову хиазму. Сірий горб - це непарний порожнистий
  8. Гіпертонічна хвороба (ГХ) - сестринський догляд в фізіотерапевтичної практиці
    Значне місце в відновлювальної терапії ГБ мають фізичні фактори. Їх дія повинна бути спрямована на: 1) поліпшення кровообігу, метаболізму і функціонального стану центральної нервової системи; 2) поліпшення гемодинаміки, зниження підвищеного тонусу судин і гіперфункції міокарда; 3) поліпшення
© 2014-2021  ibib.ltd.ua