Головна
Cоціологія || Гуманітарні науки || Мистецтво та мистецтвознавство || Історія || Медицина || Науки про Землю || Політологія || Право || Психологія || Навчальний процес || Філософія || Езотерика || Екологія || Економіка || Мови та мовознавство
ГоловнаМедицина → генетика
««   ЗМІСТ   »»

КЛОНУВАННЯ ДНК

Клон вірусу або клітин - це якась популяція, кожен член якої веде походження від одного репродукується віріона або від однієї клітини відповідно. Всі члени клону незалежно від того, чи є вони вірусами або клітинами, по суті, ідентичні вірусу або клітці, які дали початок клону; вони також ідентичні один одному. За допомогою клонування отримують чистий препарат одного генома, оскільки всі члени клону містять ідентичні ДНК. Ця концепція молекулярного клонування використовується і при отриманні чистих препаратів певних молекул рекомбінантних ДНК.

В основі молекулярного клонування лежить вбудовування потрібного фрагмента ДНК (вставки) в іншу молекулу ДНК (вектор), яка здатна переносити в клітку чужорідну ДНК і забезпечувати там її амплификацию. Як векторів найчастіше використовують бактеріальні плазміди, бактеріофаги і віруси тварин. Плазміди є кільцеві молекули двухцепочечной ДНК, що зустрічаються в клітинах бактерій і дріжджів, де вони реплікуються в процесі проліферації клітин як самостійні одиниці.

При роботі з Е. coli найчастіше використовують плазмиду pBR322 (рис. 15.5). Цей вектор був сконструйований за допомогою класичних генетичних методів (in vivo) і методів, що застосовуються при роботі з рекомбінантними ДНК, і має багато властивостей ідеального плазмідної вектора д ля клонування. Встановлено повна нуклеотидних послідовність цього вектора. Крім того, плазмида містить два селективних маркера: гени стійкості до ампіциліну і тетрацикліну. Кожен з 12 сайтів впізнавання рестріктазамі зустрічається в молекулі лише 1 раз, і це дозволяє отримувати повнорозмірні лінійні молекули з різноманітними «липкими кінцями». У нормі в клітці Е. coli може міститися до 50 копій плазміди pBR322. клітини Е. coli, містять даний вектор, вирощують в середовищі з ампіциліном або тетрацикліном, на якій клітини, що не мають цю плазміду, не ростуть. Таким чином, на такий селективної середовищі накопичуються тільки ті клітини, які містять рекомбінантний ДНК. Це властивість полегшує виділення великих кількостей рекомбінантної плаз- мідно ДНК.

Схема будови плазмідної вектора pBR322

Мал. 15.5. Схема будови плазмідної вектора pBR322: ori - точка початку реплікації; Атт Ті г - гени стійкості до ампіциліну і тетрацикліну; R - реплікон; / ?; Pu, Е, Я ...- сайти рестрикції різних рестриктаз (цифри позначають число нуклеотидних пар)

Звичайний розмір плазміди - 3-10 тис. Нуклеотидних пар. Деякі плазміди мають ще однією важливою особливістю: якщо на клітини, в яких присутній такий вектор, подіяти антибіотиком хло- рамфеніколом, то число копій плазміди в них зросте від декількох штук до 3 000. При цьому збільшується доза потрібного гена, що дозволяє отримувати вставлений в плазмиду ген (або продукт цього гена) у великих кількостях. У плазмиду можна вставляти фрагменти чужорідної ДНК розмірами не більше 10-15 тис. Пар нуклеотидів.

Коли потрібно клонувати більші фрагменти ДНК, зручніше використовувати вектори на основі помірного бактеріофага X.

Генетична карта фага X дикого типу із зазначенням сайтів рестрикції для рестриктаз представлена на рис. 15.6. Молекула ДНК фага X містить область почала реплікації, а також гени структурних вірусних білків (головки і хвостового відростка) і ферментів, які беруть участь в реплікації ДНК, лизисе інфікованих клітин і встановленні лизогении. Фаг X дуже пластичний: без порушення розвитку фага з нього можна прибрати до 25% ДНК або прибудувати до 6% зайвої ДНК. В цей фагів вектор можна вбудовувати до 23 тис. Нуклеотидних пар.

Лінійний геном бактеріофага X

Мал. 15.6. Лінійний геном бактеріофага X: світлий овал - область почала реплікації; Р-Есона - сайти; заштрихована частина - гени, необов'язкові для литичної інфекції

Плазміди і бактеріофаги - найбільш часто використовувані вектори. Але існують і інші типи векторів зі своїми перевагами. Перш за все це косміди - вектори, отримані шляхом об'єднання невеликих фрагментів бактеріофага X і плазмід. Вони містять гени, що дозволяють їм розмножуватися в бактерії, ген стійкості до тетрацикліну і особлива ділянка ДНК з бактеріофага X під назвою COS, який містить все необхідне для упаковки рекомбінантної ДНК в білкову головку фага. Косміди дозволяють отримувати гібридні молекули з довжиною вставки в 35-40 тис. Пар нуклеотидів.

За допомогою косміди і всіх вищеназваних векторів гени вводять в бактеріальні клітини. Для клітин тварин і людини вони непридатні. Справа в тому, що молекулярні механізми реалізації генетичної інформації у прокаріотів і еукаріотів різні, і бактеріальна плазмида не здатна розмножуватися в тваринній клітині.

Як векторів тварин і людини використовуються різні віруси. Так, вектор на основі вірусу SV40 збільшує число введених генів до 100 тис. Молекул на клітину. Застосовують вектори на основі вірусів папіломи, герпесу, осповакціни, адено- і ретровірусів. Особливість структури ретровируса - наявність довгих кінцевих повторів на кінцях молекули ДНК-вірусу. Ці повтори і дають можливість гібридної молекулі вбудуватися в хромосому клітини-господаря.

  1. Кровопостачання і лімфовідтік - факультетська хірургія
    Артеріальний кровопостачання включає постачання ГЦЖ через верхні щитовидні артерії (гілки зовнішніх сонних артерій), які постачають в основному верхню 1/3 часток залози. Нижні щитовидні артерії починаються від шийних стволів (гілок підключичних артерій) і постачають кров'ю 2/3 об'єму залози
  2. Кровообіг і його вікові особливості, будова і функції серцево-судинної системи - вікова фізіологія і психофізіологія
    В результаті вивчення даного розділу студент повинен: знати будова, функції та основні показники роботи серцево-судинної системи; основи нервової і гуморальної регуляції діяльності серцево-судинної системи; вікові особливості структурного і функціонального розвитку серцево-судинної системи;
  3. Кризи періоду дорослості - вікова фізіологія і психофізіологія
    У період дорослості розвиток людини супроводжується рядом нормативних криз. Їх вікові межі чітко не визначені. Особливістю цих криз є відмінність від всіх ранніх криз, пов'язане з тим, що в їх основі лежить не конфлікт інтересів, а критична переоцінка досягнутого і знаходження нових смислів
  4. Критерії нехромосомного спадкування - генетика
    Чи можна на основі простих критеріїв, що застосовуються при генетичному аналізі, розрізнити хромосомні успадкування і різні типи нехромосомной успадкування? Зазвичай це зробити нелегко, і для остаточного виведення потрібно комплекс оцінок. Нехромосомной спадкування насамперед виражається в
  5. Корковий відділ сомато-сенсорної системи, резюме, контрольні запитання та завдання, практичні завдання - фізіологія вищої нервової діяльності та сенсорних систем
    Первинними проекційними відділами соматосенсорної чутливості є область центральної борозни - поля 1, 2, 3 по Бродману. Ця область організована по соматотопичної принципом: кожній ділянці шкіри відповідає чітко певну ділянку кори б. п., і площа кори, відведеної для даної ділянки шкіри, пропорційна
  6. Кора мозочка - анатомія центральної нервової системи
    У старій і новій корі мозочка, так само як і в корі великих півкуль, існують чіткі соматотопичної проекції тіла (див. Параграф 5.4). Кора складається з трьох шарів, сумарна товщина яких приблизно 0,8 0,9 мм. Самий зовнішній шар нейронів називається молекулярним, середній - гангліозних, внутрішній
  7. Константа дисоціації. Закон розведення Оствальда - біохімія людини
    Кількісно велектролітичні дисоціацію як рівноважний оборотний процес можна охарактеризувати константою дисоціації (іонізації), яка визначається законом діючих мас. Якщо розглядати велектролітичні дисоціацію як рівноважний оборотний процес, дисоціацію електроліту Kt "Anw (Kt + - катіон, Ап"
  8. Коферментна функція вітамінів - біохімія
    О. Варбург в 1935 р при вивченні окисного розпаду вуглеводів вперше вдалося отримати в кристалічному стані кофермент глюко- зо-6-фосфатдегідрогенази. Було також встановлено наявність в його складі аміду нікотинової кислоти. Надалі виявилося, що нікотинамід є компонентом коферментів
© 2014-2022  ibib.ltd.ua