| Головна |
| «« | ЗМІСТ | »» |
|---|
У геномі кожної живої клітини закладена генетична програма, яка визначає і контролює головні реакції клітинного метаболізму.
Історія розвитку генної інженерії налічує нс більше тридцяти років. Її становлення пов'язане з конструюванням векторних молекул, отриманням рекомбінантних ДНК, а також включенням в вектори генів тварин і людини. Неможливо зв'язати генну інженерію з одним будь-яким відкриттям, так як вона являє собою сукупність прийомів і методів, спрямованих на створення штучно модифікованих генетичних програм. У попередньому розділі розглянуто процеси генетичної рекомбінації, що відбуваються при синтезі антитіл в природних умовах. Можливо ці процеси і стали поштовхом для проведення дослідів, пов'язаних з отриманням рекомбінантних генів штучним шляхом.
Для проведення генно-інженерних процедур необхідно використання ряду вузькоспеціалізованих методів. До них відносяться секве- нирование ДНК; отримання фрагментів ДНК; виділення окремих генів, необхідних для побудови генетичної програми; вибір і конструювання ген-несе вектора; вбудовування вектора в ДНК клітини-господаря.
У зазначених вище методах застосовуються такі ферменти: ендонуклеази або рестріктази: зворотна транскриптаза або ревертаза; ДНК-лігази; екзонуклеаза; лужна фосфатаза; полінуклеотідкіназа; кінцева дезаксінуклеогіділтрансфераза; ДНК-полімераза.
Гени можливо отримувати методом хімічного синтезу, виділенням з геномів живих організмів, а також за допомогою зворотної транскриптази, яка на відповідній мРНК кодує комплементарную ДНК (кДНК). Перший і другий методи мають обмежене застосування. Хімічний синтез - досить тривала і дорога процедура. Виділення однорідних фрагментів ДНК здійснюється за допомогою ферчентов-рестриктаз, які дізнаються і розщеплюють ДНК в строго фіксованих точках. Ці ферменти функціонально пов'язані з модифікують метилаз наступним чином: метилаза здійснюють метилювання в сайтах ДНК, які атакують рестріктазамі. Метилирование захищає власну ДНК клітини від неспецифічної фрагментації, в той час як чужорідна ДНК негайно руйнується. У місці розриву підлогу і нуклеотидних ланцюгів утворюються, зокрема, липкі кінці, здатні утворювати між собою комплементарні пари підстав. Відкриття В. Арбером рестрикції і використання її для отримання генів було відзначено Нобелівською премією. В даний час ідентифіковано більше 500 рестриктаз, причому їх назва складається з першої літери роду мікроорганізму і двох перших букв вила, з якого виділена ресгріктаза. Наприклад, фермент, виділений з кишкової палички Е. coli, називають Есо. При використанні фрагментів ДНК в якості носіїв генів слід враховувати те, що ДНК має мозаїчну структуру, що складається з інтронів і екзонів, а клітина-реципієнт, або компетентна клітина, як правило, позбавлена механізму сплайсингу
Найбільшого поширення набув ферментативний метод отримання генів. З клітин виділяють сумарну фракцію матричних РНК, потім через иммунопреципитации осаджують мРНК, кодованих геном, який є кінцевою метою виділення. Моновалентною антитіла беруться з наборів або виходять в лабораторних умовах за допомогою кодованого цільовим геном 2> на матриці мРНК синтезується комплементарна кДНК. Однак для функціонування ревертази необхідна запал. Для цього до мРНК додають Політило, яка з З'-кінцевий Поліани мРНК утворює двухнепочечний ділянку, званий шпилькою. Ця ділянка і є приманкою для дії ревертази. Синтез другий ланцюга ДНК проводять за допомогою зворотної транскриптази і фрагмента ДНК-полімерази 1 (фрагмента Кленова), виділеної з Е. coli. Потім шпилька вирізається за допомогою нук- ЛЕАЗ S, і виділяється штучно створена дволанцюжкова ДНК, що кодує заданий білок. Для включення в плазміду фрагмент ДНК постачають липкими кінцями. До 3'-кінців обох ланцюгів за допомогою термінальної трансферази приєднують послідовності Поліани розміром 50-70 залишків аденіну. Після цього кДНК готова до включення в компетентну клітку. Якщо ця рекомбінантна ДНК потрапить в клітини самостійно, вона буде негайно зруйнована ендогенними рестріктазамі, тому для її доставки в клітини використовують плазміди, фаги або віруси. Дані структури називаються векторами, і саме вони переносять в клітку відповідну генетичну інформацію. Ці процедури мають першорядне значення для генної інженерії, тому розглянемо їх більш детально.
Плазміди є кільцеві ДНК, локалізовані в бактеріальних клітинах. І хоча вони займають всього лише кілька відсотків генетичного матеріалу, їх біологічна значимість досить велика. Вони містять інформацію про резистентності до різних токсичних речовин, наприклад до антибіотиків, а також беруть участь в засвоєнні клітиною деяких поживних речовин. У бактеріальних клітинах кількість плазмід варіює в межах від одиниць до сотні, причому їх реплікація автономна і не пов'язана з реплікацією хромосоми. Плазміди є набагато більш мобільним сховищем генетичного матеріалу, ніж хромосома, і при кон'югації клітин обмін генами відбувається тільки за рахунок цих структур.
Нативная плазмида може бути використана в якості вектора тільки після відповідної модифікації. Спочатку її переводять в лінійну форму за допомогою рестріктази з утворенням тупих кінців. Для об'єднання з кДНК до З'-кінців лінійної плазміди приєднують кінці, комплементарні кінців кДНК, т. Е. Політило, або ж створюють спеціальні олігонуклеотиди - лінкери і адаптери, що сприяють утворенню липких кінців. Лінкер приєднують до ДНК, а потім за допомогою відповідної рестрік- тази отримують фрагмент ДНК з липкими кінцями. Для об'єднання фрагментів з різними липкими кінцями застосовують послідовність нуклеотидів, яка називається адаптером. Як векторів використовують також ряд фагів, причому найбільш зручним є фаг X. З вірусних частинок в якості векторів найчастіше використовують мавпячий вірус SV-40.
Після отримання вектора, з'єднаного з кДНК, можна приступати до трансформації компетентних, т. Е. Здатних до трансформації, клітин. При взаємодії векторів, навантажених кДНК, з компетентними клітинами в деяких з них проникає чужорідна ДНК, що веде до утворення трансформованих клітин. Ці клітини відбирають і клонують з метою отримання копій цільового гена. Ідентифікація клітин, які мають цільовий ген, часто визначає успіх проведення генно-інженерних розробок і проводиться в два етапи.
«Відбір клітин, які мають вектор, сконструйований для даної генно інженерної процедури. Для полегшення відбору в вектор попередньо вводяться генетичні маркери, наприклад гени стійкості до антибіотиків. При висіві на середовищі з відповідним антибіотиком дана бактеріальна популяція буде нечутлива до нього.
* Відбір клітин, які мають крім вектора цільової ген. Для цієї мети використовують два варіанти ідентифікації:
Є два типи векторів: звичайні і спеціалізовані. звичайні вектори клонування дають можливість з величезної кількості генів вибрати шуканий і створити «бібліотеку» генів, а спеціалізовані пов'язані з експресією генів. Звичайні вектори застосовують в основному для виділення і вивчення генів, що входять до складу геному різних клітин. Що стосується спеціалізованих векторів, то вони становлять особливий інтерес для біотехнології, так як експресія відповідних генів дає підставу для понад синтезу цільових продуктів. Для цього ген, що кодує необхідний білок, вводиться в хромосому компетентних клітин і асоціюється з промотором.