| Головна |
| ЗМІСТ | »» |
|---|
В результаті вивчення даного розділу студент повинен:
знати
вміти
володіти
Багато методи вивчення морфології НС є общеанатомічними, які умовно можна розділити на макро- і мікроскопічні. Перші досліджують будову всього організму, його систем, окремих органів і їх частин. Мікроскопічні методи вивчають будову клітин і тканин організму, будучи в той же час методами цитології і гістології. Існують і специфічні методи для вивчення будови саме НС, пов'язані з особливостями її будови і функціонування.
Методики вивчення НС дуже численні, в цьому розділі ми опишемо основні з них, а також найбільш часто вживані в даний час.
З давніх часів і аж до винаходу мікроскопа основним методом в анатомії був метод розтину, препарування, що і дало назву цій науці (від грец. avaxopr | - розсічення). Це метод посмертного вивчення мозку, який після вилучення з порожнини черепа (ГМ) або з хребетного каналу (СМ) спочатку фіксується в розчинах формаліну або різних спиртів, що необхідно для його ущільнення і тривалого зберігання. Після цього можна розділяти мозок на частини, вивчаючи їх будову, а також здійснювати власне розсічення - розрізати в різних площинах, простежуючи переходи однієї структури в іншу.
Принципово новий підхід до вивчення анатомії дало винахід мікроскопа в XVII в. Основною характеристикою будь-оптичної системи є її роздільна здатність, або просто дозвіл, - найменша відстань між двома точками, при якому їх можна сприймати як різні. Для нормального ока, як біологічної оптичної системи мінімальний дозвіл при найбільш оптимальних умовах в середньому дорівнює 0,176 мм. Розміри більшості клітин і мікроорганізмів набагато менше. Для вивчення таких біологічних (а також хімічних і фізичних) об'єктів і потрібен мікроскоп.
Винахід мікроскопа пов'язують з іменами голландця 3. Янсена та італійця Г. Галілея. Кращі мікроскопи в XVII в. (Мікроскопи Левенгука) збільшували спостережувані об'єкти в 300 раз. Сучасні світлові мікроскопи мають роздільну здатність 130-350 нм (0,13-0,35 мкм), т. Е. Можуть збільшувати об'єкт у 2500-3000 разів. Завдяки цьому за допомогою світлового мікроскопа можна бачити не тільки самі клітини, але і клітинні органели. Першим побачив, описав і дав побаченому назва «клітка» (Cell) англійський фізик Р. Гук в 1665 р
У XX ст. був винайдений електронний мікроскоп, який може дати збільшення в 106 раз. У сучасних електронних мікроскопах роздільна здатність становить 0,1-0,7 нм (в теорії до 0,002 нм). Такий мікроскоп дозволяє вивчати клітини на макромолекулярному рівні (наприклад, побачити молекулу ДНК), а також отримувати відомості про об'ємної організації клітини. Недоліком електронної мікроскопії з точки зору біології є неможливість вивчення живих об'єктів.
Останнім досягненням в області мікроскопії був винахід папоскопа - флуоресцентного мікроскопа, що дозволяє бачити об'єкти з дозволом 10-30 нм, т. е. на нанорівні. На відміну від електронного мікроскопа, за допомогою наноскопа можна спостерігати живі об'єкти, при цьому не тільки побачити фрагменти органоїдів, а й спостерігати, наприклад, взаємодія білків один з одним. «За створення флюоресцентной мікроскопії високого дозволу» винахідникам наноскопа німецькому вченому Ш. Хеллі і американським вченим Е. Ерік Бетциґ і У. Мернер в 2014 р було присуджено Нобелівську премію з хімії.
мікроскопічні дослідження проводяться або на живих клітинах (вітальне вивчення), або на клітинах, які попередньо піддаються різним способам фіксації, їх вбиває. Ще А. Левенгук спостерігав у краплі води під мікроскопом рухомі мікроорганізми. Але для багатоклітинних організмів такий спосіб вивчення неможливий. Для спостереження клітин і тканин багатоклітинного організму найчастіше використовують метод клітинних культур. Для цього одну або кілька живих клітин поміщають в живильне середовище, де вони можуть продовжувати життєдіяльність, зберігаючи при цьому здатність до поділу. Зазвичай в результаті розмноження утворюється одношаровий пласт клітин, дуже зручний для прижиттєвого дослідження. Найкращі результати виходять при використанні в якості вихідного матеріалу стовбурових клітин, що володіють максимальною здатністю до поділу.
Метод клітинних культур дає можливість вивчати розподіл і ріст клітин, їх диференціювання, взаємодія з іншими клітинами, вплив на них біологічно активних речовин і т. Д. Для культивування різних видів клітин розроблені спеціальні середовища, необхідні для їх життєдіяльності і розмноження, наприклад, для розвитку нейронів необхідні нейротрофіни (фактори росту нервів).
Але методи культивування клітин були розроблені тільки в XX ст., Так що перші нейрони побачили за допомогою методів фіксації. Головне завдання при фіксації клітин - це якнайкраще зберегти прижиттєву структуру клітини і не допустити появи в ній артефактних, т. Е. Відсутніх в живій клітині, структур. Поки що ця задача остаточно не вирішена. Найчастіше для фіксації використовуються формальдегід або формалін і спирти. При дослідженнях за допомогою електронного мікроскопа хороші результати дає кріофіксація (Заморожування) об'єкта.
Для приготування препарату для мікроскопії після фіксації органу або його частини необхідно приготувати тонкі зрізи товщиною для світлового мікроскопа 5-10 мкм, а для електронного - не більш 0,1 мкм. Це робиться за допомогою спеціального приладу - мікротома або ультрамікротома для електронної мікроскопії. Після цього зрізи піддають додатковій обробці, наприклад фарбування в світловій мікроскопії або напилювання солями металів - в електронній. Це підсилює контрастність досліджуваного об'єкта і дозволяє виявити в ньому ряд деталей. Методи фарбування дуже численні і різноманітні, їх вибирають в залежності від завдань дослідження. Щоб забезпечити тривале зберігання препарату, його заливають канадським бальзамом і зверху накривають покривним склом.
Найбільше значення для вивчення нервової тканини мали методи забарвлення по методикам К. Гольджі, С. Рамон-і-Кахаля і Ф. Нісль (див. Параграф 17.3).
Для розуміння роботи НС абсолютно необхідно не тільки знати будову окремих мозкових структур, а й розуміти, як ці структури пов'язані один з одним, т. Е. Добре знати хід нервових волокон.
До XX в. основним методом для простеження ходу нервових шляхів був ме? під порівняння послідовних зрізів одного напрямку, вперше застосований німецьким анатомом і хірургом Б. Штіллінга (1810-1879). При порівнянні таких зрізів в деяких випадках можна простежити напрямок, в якому йде пучок нервових волокон, і зрозуміти, які структури він з'єднує. Цей метод можна застосовувати далеко не у всіх випадках. Волокна різних трактів можуть проходити частину шляху разом, від них можуть відходити колатералі, та й самі шляхи можуть бути дуже невеликими і насилу відзначаються окремо від навколишньої тканини.
Надалі з'явилося безліч інших методів для визначення ходу нервових волокон. Відзначимо деякі з них.
Метод вторинних перероджень заснований на відкритому в середині XIX в. британським нейрофізіологом А. Валлера явище, названим валлеровского дегенерацією: якщо волокно відокремлено від клітини, воно перероджується (дегенерує). Цей метод був удосконалений американським вченим У. Наута (1916-1994), який використовував той факт, що при дегенерації волокна воно забарвлюється не так, як сусідні неушкоджені волокна. Тому можна зруйнувати будь-яку структуру і через кілька днів, пофарбувавши мозок, простежити, куди вона посилає свої аксони.
Ряд методів вивчення мозкових зв'язків заснований на використанні аксонного транспорту, як антероградного, так і ретроградного (див. параграф 2.3). Наприклад, фермент пероксидаза хрону може захоплюватися з навколишнього середовища нервовими закінченнями і ретроградним аксони транспортом доставлятися в тіло нейрона. Присутність цього ферменту в клітині визначається спеціальними біохімічними методами, що дає можливість простежити хід нервового волокна. Або, використовуючи радіоав- графічною методи, можна ввести в будь-яку мозкову структуру речовина з радіоактивною міткою, яке поглинається сомой нейронів, транспортується по аксонах і накопичується в їх закінченнях.
Сучасна анатомія тісно взаємодіє з фізіологією, знання функцій відділів головного мозку дозволяє краще зрозуміти їх будову, тому в анатомії досить широко використовувалися і фізіологічні методики - перерізання нервів і провідних шляхів, руйнування окремих структур, роздратування ділянок мозку. Спостерігаючи порушення будь-яких функцій організму після перерезок і руйнувань, можна було судити про значення відділів мозку в організації цих функцій.
метод роздратування застосовувався ще в XIX в. При його допомозі видатний російський фізіолог І. М. Сєченов (1829-1905) відкрив явище центрального (сеченовский) гальмування. У XX ст. канадський нейрохірург У. Г. Пенфілд (1891 - 1976) застосував цей метод під час нейрохірургічних операцій на відкритому мозку. Він проводив електричну стимуляцію різних відділів мозку, хворі (які в цей час перебували в свідомості) звітували в своїх відчуттях. Проаналізувавши отримані дані, Пенфилд створив функціональні карти поверхні кори великих півкуль (пенфілдовскій гомункулус, див. Пункт 9.3).
Практично всі викладені вище методи - це методи посмертні або інвазивні, т. е. що вимагають порушення цілісності організму. Природно, на живу людину застосовувати ці методи неможливо. Винятком є тільки дослідження, що проводяться при операціях на мозку, по вони бувають обумовлені медичними показаннями.
У другій половині XX в. почали інтенсивно розвиватися фізіологічні неінвазивні методи дослідження мозку, такі як електроенцефалографія (ЕЕГ), магнітоенцефалографія (Мег), реоенцефалографія (РЕГ), доплерографія та ін. За допомогою ЕЕГ досліджується сумарна електрична активність поверхні мозку в нормі, при функціональних навантаженнях і при патології. Мег реєструє магнітну складову електромагнітного нуля ГМ. Мег має деякі переваги в порівнянні з ЕЕГ. Цей метод реєстрації не тільки неінвазивний, але і безконтактний, т. Е. Випробуваний відчуває себе більш комфортно. І головне, Мег відображає не тільки поверхневу, а й глибинну активність мозку. РЕГ і доплерографія (ультразвукове дослідження) показують стан кровоносних судин мозку і широко використовуються при медичній діагностиці. Але всі ці методи не дають можливості отримати дані про чисто анатомічну будову мозкових структур. Ця проблема почала вирішуватися з появою методів нейровізуалізації (нейроіміджінга).
Нейро візуалізація - загальна назва кількох методів, що дозволяють в наочній формі візуалізувати прижиттєві структуру, функції і біохімічні характеристики мозку. Всі ці методи можна розділити на дві групи - структурні, що дозволяють вивчати будову мозку, і функціональні, що відображають мозкову активність (кровотік, медіаторно-рецепторні характеристики і т. П.).
До структурним методам можна віднести комп'ютерну томографію (КТ), магнітно-резонансну томографію (МРТ), МРТ-ангіографію.
Основні функціональні методи - це позитронно-емісійна томографія (ПЕТ) і функціональна магнітно-резонансна томографія (фМРТ).
З розвитком комп'ютерної техніки такі методи дослідження, як ЕЕГ і Мег, також дозволяють візуалізувати мозкову активність. Створено ряд комп'ютерних програм, таких як Брейн-Лок, CONAN, LORETA, що дають можливість на підставі електричної і магнітної активності мозку відстежувати тонкі зміни функціонального стану людини. Ці програми використовуються в неврології і психіатрії для постановки діагнозу, а також в психофізіологічних дослідженнях. В даний час ЕЕГ-картування мозку є найбільш доступним і широко поширеним методом функціональної нейровізуалізації.
Загальним для всіх томографічних методів є зображення мозкових структур, представлених у вигляді зрізів в різних площинах. В історії вивчення анатомії є аналоги томографічних методів. Великий російський хірург М. І. Пирогов (1810-1881) для вивчення взаєморозташування органів розробив метод «топографічної анатомії», при якому вивчалися пошарово розрізані в різних площинах заморожені трупи. За результатами дослідження Пироговим було видано атлас, зображення в якому схожі з сьогоднішніми томограммами.
Сучасні томографічні методи вперше дозволили зазирнути в глибини організму, в тому числі і мозку, живу людину. Першим таким методом стала Комп'ютерна томографія (Рентгенівська КТ). При звичайному рентгенівському обстеженні можна побачити тільки кістки черепа. Методом КТ отримують зображення томограм - зрізів мозку товщиною 3-10 мм в подовжньому і поперечних перетинах. В основі методу лежить комп'ютерна реконструкція зображення, яке отримують при круговому просвічуванні об'єкта вузьким пучком рентгенівського випромінювання. Програма обчислює ступінь поглинання цих променів структурами НС, добре відрізняє м'які тканини від оточуючих їх тканин і будує томограми - зображення зрізів мозку товщиною 3-10 мм. Іноді для збільшення контрастності зображення в організм вводять йод-містять препарати. КТ надає детальну інформацію не тільки про будову здорового мозку, а й про порушення його структури. Наприклад, у багатьох хворих на шизофренію було виявлено розширення латеральних і III мозкових шлуночків, збільшення обсягу або, навпаки, часткова атрофія каллозальних волокон (волокон мозолистого тіла), морфологічна асиметрія ГМ.
У 1979 р за розробку методу комп'ютерної томографії англійський інженер-фізик Г. Н. Хаунсфілд і американський фізик А. М. Кормак були удостоєні Нобелівської премії з фізіології і медицині.
Провідним неінвазивним методом нейровізуалізації в даний час є магнітно-резонансна (МРТ) або ядерно-магнітно-резонансна (ЯМР) томографія. Цей метод, що з'явився в 1970-х рр., Заснований на фізичному явищі протонного магнітного резонансу. Суть його полягає в наступному. Протони - ядра атомів водню (і деякі інші ядра) - мають власне магнітне поле. Коли зразок поміщають в потужне постійне магнітне поле, мікромагнітние поля протонів вирівнюються паралельно силовим лініям зовнішнього поля. Якщо в цей час впливати на об'єкт радіохвилями певної (резонансної) частоти, то паралельно орієнтовані протони будуть поглинати енергію радіохвиль і переходити в високоенергетичне стан. Після виключення радіочастотних імпульсів протягом деякого часу (час релаксації) протони повертаються в початковий стан, виділяючи при цьому енергію. Енергія радіохвиль, необхідна для отримання резонансу, залежить від величини зовнішнього магнітного поля і від хімічного оточення ядра. Так як таке явище можливо і для ядер деяких інших атомів, його називають ядерно-магнітним резонансом.
У тілі людини дуже багато води, кожна молекула якої (Н20) включає два протона. Якщо обробити резонансні сигнали від цих протонів, можна з'ясувати, який зміст води в тканинах організму. При MPT-дослідженні зовнішнє магнітне поле організовано таким чином, що в кожній точці простору, в якому знаходиться людина, напруженість магнітного поля дещо відмінна від сусідньої точки. Це дає можливість реєструвати ЯМР від невеликих ділянок тіла і за допомогою комп'ютера створювати пошарове або об'ємне (3D) зображення організму. За допомогою методу МРТ можна сканувати будь-яку частину тіла в будь-якому напрямку. Просторова роздільна здатність методу МРТ становить 1-2 мм, його можна підвищити внутрішньовенним введенням контрастують препаратів.
Якість зображення при МРТ вище, ніж при КТ. МРТ-зображення набагато контрастніше, на них дуже чітко розрізняються сіра і біла речовина мозку, краще візуалізуються глибинні структури мозку, відсутні характерні для КТ артефакти. Також важливо, що цей метод не пов'язаний з впливом на організм рентгенівського випромінювання.
Але і метод КТ має свої переваги. МРТ, на відміну від КТ, не може виявити деякі патологічні зміни мозкової тканини, наприклад присутність кальцификатов. Крім того, МРТ не застосовується до пацієнтів з металевими тілами в черепі і з кардіостимулятором.
Проведення і КТ, і МРТ пов'язано з тим, що людина деякий час знаходиться у вузькому замкнутому просторі, тому людям, що страждають на клаустрофобію, деяким психіатричним хворим, а також маленьким дітям ці процедури протипоказані. Але час перебування в камері при КТ набагато менше, ніж при МРТ, тому при необхідності томографічного обстеження таких хворих переважно вибирають КТ.
Проте метод МРТ майже не має недоліків (якщо не брати до уваги його дорожнечу). Винахідники це методу британський вчений П. Менсфілд і американський вчений П. К. Лотербур в 2003 р були також удостоєні Нобелівської премії.
На базі методу МРТ було створено кілька його модифікацій, наприклад МРТ-ангіографія, що дозволяє отримувати зображення кровоносних судин завдяки тому, що магніто-резонансний сигнал від рухомої тканини (кров) відрізняється від МР-сигналів, що лежать навколо нерухомих тканин. Дифузійна тензорна візуалізація (ДТВ) дає можливість побачити пучки нервових волокон, які з'єднують різні зони ГМ, а також виявити локалізацію ураження провідних шляхів.
Для наукових досліджень особливо важлива поява функціональних методів дослідження. функціональна МРТ (фМРТ) дозволяє визначити функціональні особливості різних ділянок мозку, завдяки тому що в активно працюючих областях кровотік посилюється. За допомогою МРТ можна простежити, які області активуються при виконанні випробуваним різних завдань. МР-спектроскопія дає можливість візуалізувати не тільки анатомічну структуру мозку, а й розподіл у ньому ряду біологічно активних речовин, наприклад нейромедіаторів.
Ще один новітній функціональний томографічний метод - це позитронно-емісійна томографія (ПЕТ), що дозволяє вивчати діяльність мозку на нейро-медіаторно-рецепторном рівні. Перед дослідженням в організм людини вводиться радіофармпрепарат, т. Е. Препарат, мічений ізотопом, що випромінюють позитрони (наприклад, ізотопи фтор дезоксиглюкозу, мічені агоністи рецепторів, попередники медіаторів). Позитрони не ушкоджують живу тканину, але уловлюються томографом. Залежно від використовуваного препарату можна досліджувати такі процеси, як транспорт речовин, взаємодія між медіатором і рецептором, метаболічні зміни та т. Д. Таким чином, ПЕТ, на відміну від комп'ютерної та магнітно-резонансної томографії, оцінює функціональні зміни па клітинному рівні. Такі зміни часто передують морфологічним змінам, тому ПЕТ може діагностувати розвиток захворювання набагато раніше, ніж КТ і МРТ.
Відзначимо ще кілька методів дослідження будови мозку, що з'явилися вже в XXI ст.
Брейнбоу (Англ, brainbow) - ще один метод нейровізуалізації, при якому нейрони фарбуються флуоресцентними білками. Спочатку для фарбування клітин використовували зелений флуоресцентний білок {Green fluorescent protein, GFP), виділений з світиться медузи еквореі {Aequorea victoria), Який флуоресціює в зеленому діапазоні при висвітленні його синім світлом. В даний час ген цього білка широко використовується в якості світиться мітки в клітинної та молекулярної біології. Виведено спеціальні «світяться» тварини (наприклад, свині), у яких GFP внесений в геном і передається у спадок. Надалі були отримані кілька мутацій, спрямованих на зміну кольору світіння білка. Були отримані варіанти з червоним, оранжевим, блакитним, синім і жовтим світлом.
метод Brainbow був спочатку розроблений в 2007 р групою американських вчених в відділі нейробіології медичної школи Гарварда. Вони розробили генетичний метод маркування кожного окремого нейрона в свій колір (зараз вже можливо фарбувати нейрони в 90 різних кольорів). На фотографіях, зроблених за допомогою цього методу, можна побачити не тільки взаємне розташування нейронів, а й простежити хід окремих нервових волокон. Свою назву метод отримав від поєднання англійських слів brain (Мозок) і rainbow (Веселка); дійсно, зображення забарвлених в різні кольори нейронів нагадують веселку.
Особливо велику увагу нейробіологів привертає кора великих півкуль, так як більшість вищих пізнавальних функцій пов'язують саме з корою. Важливо й те, що нерідко неврологічні захворювання змінюють її структуру.
Більш детальне вивчення корковою поверхні стало можливо завдяки ряду комп'ютерних програм, що дозволяють візулізіровать експериментальні дані МРТ, ЕЕГ і Мег з накладенням безпосередньо на віртуальну інтерактивну поверхню мозку. У числі таких широко використовуваних програм і плагінів слід особливо виділити FreeSurfer, відрізняється наочністю і простотою використання. У програмах такого роду можна отримати «роздутий (розгладженими) мозок» {Inflated brain surface). Програмні інструменти проектують корковую поверхню на топологічно еквівалентну їй сферичну поверхню, причому ступінь «роздутість» можна варіювати за бажанням у всьому діапазоні від анатомічно коректного тривимірного представлення до гладкою сферичної поверхні. Також нерідко застосовується розгортка поверхні мозку на площину (з окремими нечисленними розривами). В результаті таких перетворень коркові поверхні, приховані в глибині борозен, виявляються на поверхні і добре видимі. Для наочності області кори всередині борозен зазвичай показуються більш темним кольором, ніж поверхня звивин. Все це дає можливість більш точно розрахувати площа кори великих півкуль, побачити взаємне розташування областей в тривимірному просторі, а також більш наочно картировать функціональні зони кори, що істотно полегшує роботу з різними експериментальними даними, як структурними (наприклад, дослідження товщини кори), так і функціональними (наприклад, активація областей кори).