| Головна |
| «« | ЗМІСТ | »» |
|---|
Все більш широке застосування в відновної медицини знаходять методи клінічної діагностики ДНК. Досягнення в галузі молекулярної біології поглибили знання про експресії генів і причини багатьох хвороб, сприяли розробці нових підходів до діагностики та лікування таких хвороб.
Встановлено, що варіабельність (поліморфізм) генів широко поширена в популяції людей. Показано взаємозв'язок між змінами в структурі ДНК і багатьма хворобами. Ідентифікація генів, порушення роботи яких призводить до розвитку спадкових захворювань, створила передумови для докладного аналізу генетичних і біохімічних основ патогенезу цих захворювань і розробки найбільш ефективних методів лікування.
Методами молекулярної медицини отримані вакцини для запобігання гепатитів, інсулін людини - для лікування цукрового діабету, фактор VIII - для відновлення нормального згортання крові і лікування гемофілії, а також багато інших препаратів.
За допомогою генної терапії виявилося можливим вводити в організм хворого повноцінно працюють гени для відновлення метаболічних порушень, викликаних мутантними генами. Цим способом здійснюється лікування дітей з імунодефіцитом, викликаним дефектом структури ферменту аденозил дезам і на- зи. На стадії клінічних випробувань знаходяться методи генокоррекціі таких спадкових хвороб, як сімейна гіперхолестеринемія, гемофілія В і деякі інші захворювання.
Для виявлення дефектів в структурі ДНК вона повинна бути виділена з відповідною біопроб (біологічної рідини, биоптата, культури клітин) і «напрацьована» в кількостях, достатніх для дослідження. Для генотерапіі необхідно виділення нормальних генів і введення їх в дефектні клітини таким чином, щоб вони експресуватися, дозволяючи відновити здоров'я пацієнта.
ДНК може бути виділена з будь-якого виду тканин і клітин, що містять ядра. Етапи виділення ДНК включають швидкий лізис клітин, видалення фрагментів клітинних органел і мембран за допомогою цін гріфугірованія, ферментативне руйнування білків протеиназами і екстрагування ДНК з розчину за допомогою фенолу і хлороформу. Потім Д1IK осаджують, як правило, етанолом і після видалення надосадової рідини розчиняють в буферному розчині.
Оцінку якості екстрагованої ДНК проводять спектрально на підставі вимірювання оптичної щільності розчину ДНК в області білкового і нуклеїнового спектрів поглинання, т. Е. При довжині хвилі 280 і 260 нм відповідно. Для чистих зразків ДНК співвідношення оптичної щільності, отриманих при 260 і 280 нм, має бути близько 2.
Молекула ДНК однієї хромосоми середнього розміру містить 150 млн (150-106) Пар нуклеотидів і має довжину близько 4 см. Молекулярні нитки такого розміру чутливі до механічних впливів при виділенні з розчину і часто фрагментируются - розщеплюються на фрагменти. В ході виділення отримують молекули ДНК значно менше вихідних, але все одно містять тисячі або десятки тисяч пар нуклеотидів. Такі молекули незручні для дослідження, і їх доводиться додатково фрагментировать.
Для фрагментирования ДНК використовують ферменти, що розщеплюють ДНК, ре- стріктази або рестрикційні ендонуклеази, виділені з бактеріальних клітин. У бактеріальних клітинах (In vivo) Ці ферменти визначають (дізнаються) і руйнують чужорідні ДНК, розщеплюючи їх на невеликі фрагменти.
Рестріктази розпізнають специфічні послідовності з 4-6, рідше 8-12 нуклеотидів в двухцепочечной молекулі ДНК (сайти рестрикції) і «розрізають» її в місцях локалізації цих послідовностей. Кількість рестрикційних фрагментів ДНК при використанні однієї рестріктази залежить від числа сайтів рестрикції, а розмір фрагмента визначається положенням цих сайтів по всій довжині вихідної молекули ДНК.
Відомо більше 500 різних типів рестриктаз бактеріального походження, причому кожен з цих ферментів розпізнає свою специфічну послідовність. За допомогою набору рестриктаз можна розрізати молекулу ДНК на фрагменти потрібної довжини.
Наприклад, для вивчення первинної структури ДНК (метод секвенування) зручні фрагменти, що складаються приблизно з 300 пар нуклеотидів. Отже, молекулу ДНК однієї хромосоми, що містить 150-106 пар нуклеотидів, потрібно розрізати на 500 000 фрагментів і кожен з фрагментів вивчати окремо.
Отримані при рестрикції фрагменти ДНК можуть бути досліджені методом електрофорезу в агарозному або поліакриламідному гелі. Визначають ДНК в гелі по ультрафіолетовим спектрами після обробки бромидом етидія, що зв'язуються з фрагментами молекули і дає специфічне рожеве забарвлення.
При обробці геномної еукаріотичної ДНК, зокрема ДНК людини, рестріктазамі утворюється багато фрагментів різної довжини. Ідентифікацію специфічних послідовностей у фрагментах ДНК в гелі проводять після поділу за допомогою електрофорезу шляхом гібридизації з міченими ДНК-зондами, які представляють собою фрагменти однонитевой ДНК довжиною понад 100 нуклеотидних ланок зі строго визначеною первинною структурою. Синтез ДНК-зондів здійснюється в автоматизованих машинах. Такі молекули можна використовувати для специфічного зв'язування з досліджуваними ділянками фрагментів.
Високочутливим методом ідентифікації ділянок ДНК є метод блот-гібридизації за Саузерну. Суть методу полягає в тому, що суцільний ряд смужок з фрагментів ДНК, отриманий в результаті їх поділу за молекулярною масою в гелях, піддається денатурації і переноситься з гелю на нітроцелюлозний фільтр або нейлонову мембрану. Перенесення, або блот, здійснюється за рахунок капілярних сил, електричного поля або вакууму. Фіксовану на фільтрі ДНК гібрідізіруют з ДНК або РНК-зондом. Потім методом радиоавтографии визначають положення шуканого фрагмента геномної ДНК на електрофореграмме.
Для встановлення первинної структури ДНК (секвенування ДНК) розроблені ефективні і економічні методи. В одному з них з 4 нуклеозідтріфосфа- тов (dATO, бГТФ, (1СТФ, сПТФ) синтезують набір олігонуклеотидів (наприклад, октонуклеотідов), що включають всі можливі варіанти послідовностей. Ці октонуклеотіди иммобилизуют шляхом зв'язування з носієм. В результаті створюється олігонуклеотидних матриця. Секвенируемой фрагмент ДНК мітять радіоактивною міткою по фосфатного залишку і додають в осередку з різними матрицями. Досліджуваний фрагмент ДНК зв'язується (гібрідізіруют) тільки з тими октонукле- відійшов, послідовності яких комплементу ни цього фрагменту. Таким чином визначається набір всіх можливих октонуклеотідов, присутніх в досліджуваному фрагменті ДНК. Далі за допомогою спеціальної комп'ютерної обробки упорядковується розташування октомеров у фрагменті ДНК.
Всі методи розділення сумішей засновані на тому, що компоненти, що розділяються в результаті будь-яких маніпуляцій виявляються в різних ділянках системи і можуть бути механічно відокремлені один від одного.
Найбільш продуктивні процедури поділу засновані на різному розподілі речовин між двома фазами. Будь-яка така процедура призводить до поділу вихідної суміші на дві частини (фракції), в одну з яких переважно або повністю переходить виділяється компонент.
З огляду на виняткову складність сумішей, з якими мають справу біохіміки, на перших етапах поділу в переважній більшості випадків фракція, яка містить виділяється речовина, містить безліч інших компонентів, т. Е. Відбувається лише часткове очищення (збагачення суміші шуканим компонентом).
Виділення індивідуальних біополімерів - ДНК, РНК, білків - є тому багатоступеневим процесом. На кожному ступені поділу повинна виходити фракція, багатша виділеним речовиною, ніж на попередньому щаблі, і містить менше число побічних компонентів. Такий процес часто називають фракционированием.
На кожній стадії поділу, включаючи початкову, біополімер знаходиться або в вигляді розчину, або у вигляді осаду.
До методів розділення сумішей відносяться осадження, фільтрування, екстракція, сорбція, гель-фільтрація, діаліз, ультрафільтрація, хроматографія, висолювання.
Як при виділенні і очищенні біополімерів, так і при проведенні різноманітних досліджень необхідно кількісне визначення вмісту биополимера в отриманої фракції, в виділеному або досліджуваному зразку. Біохімічні дослідження проводяться, як правило, з дуже невеликою кількістю матеріалу і тому вимагають високочутливих методів вимірювання. Найбільш широко поширені методи засновані на вимірі оптичного поглинання (спектрофотометрія), радіоактивності (радиохимичні методи) або світіння зразків (люмінесцентні методи).
Особливо революционизирующее вплив на експериментальні можливості біохімії зробило застосування ферментів матричного біосинтезу, в першу чергу ДНК-полімерази. Аналітичні можливості в біохімії нуклеїнових кислот незмірно зросли з появою методу ампліфікації, т. Е. Розмноження молекул ДНК з певною послідовністю нуклеотидів за допомогою ДНК-полімерази. Завдяки застосуванню прямий і зворотній транскрипції багато методи, розроблені для ДНК, перенесені на РНК.
Здатність живих ор [анізм і самих молекул ДНК до розмноження дозволила залучити селекційні методи для вирішення біохімічних задач. Можливість вирізання з ДНК певних генів, отримання їх шляхом зворотної транскрипції матричних РНК та розробка методів штучного хімікоферментатівного синтезугенів дозволили маніпулювати генами, в тому числі вставляти їх в плазміди або віруси, а потім вносити їх в мікроорганізми для подальшого розмноження.
За допомогою мікробіологічних методів розроблені методи селекції тих популяцій мікроорганізмів (клонів), які виросли з окремих клітин, які мають бажані ознаки, наприклад здатних продукувати певні білки, не властиві цим організмам. Гак народилася генна інженерія, яка не тільки відкрила нові горизонти в біотехнології, а й стала найважливішим інструментом біохімічних досліджень.
Селекція ДНК або РНК з штучно створеної суміші величезного числа різних молекул нуклеїнових кислот з подальшим розмноженням відібраних ДНК методом ампліфікації відкрила шлях до створення нуклеїнових кислот з найрізноманітнішими заданими властивостями.
Питання і завдання до гл. 9
1. Використовуючи рівняння, записані в словесній формі, і знаючи хімічну структуру кожного проміжного продукту, запишіть послідовність хімічних перетворень (метаболічний шлях), з яких складається процес розщеплення глицеральдегид-3-фосфату до етанолу.
Гліцеральдегід-З-фосфат + Р + NAD - О-Фосфогліцероілфосфат + NADH + bf,
Фосфоенол бенкеті ват + ADP -? Піруват + А ГР,
Етанол + NAD «- * Ацетальдегід + NADH + Н+,
З-Фосфогліцероілфосфат + ADP -? З-фосфогліцерат + АТР,
Піруват - * СО2 + Ацетальдегід.
Зобразіть даний метаболічний шлях. Вкажіть, як пов'язані між собою окремі частини цього шляху.