| Головна |
| «« | ЗМІСТ | »» |
|---|
Після стадії концентрування виходить продукт або сирець, що містить 50-80% цільового речовини. На заключних стадіях виділення та очищення застосовують різні хроматографічні методи.
Молекулярно-ситова хроматографія. При даному виді хроматографії використовується здатність матеріалів з контрольованою пористістю сортувати і розділяти компоненти суміші відповідно до розмірів і формою їх молекул. Для здійснення процесу гель-хроматографії використовуються гелі поперечно-ємнісного декстрану (сефадексе і сефакріли), поперечно-зшиті поліакриламідні гранули (біогелі), агарозній гелі з вираженими в них ланцюгами акріламідного полімеру (ультрагелі) і більш жорсткі поперечно-зшиті агарози (CL-агарози і сефакріли-S), за допомогою яких можна швидко розділити макромолекули в відповідно до їх розміру. Ступінь утримування розчиненої речовини на колонці залежить від його здатності проникати в пори гелю. Тому при гель-фільтрації спочатку виходять високомолекулярні речовини, а потім речовини в порядку убування їх молекулярних мас, т. Е. Гель виконує роль молекулярного сита. Цей спосіб особливо ефективний на заключних стадіях виділення та очищення речовин.
Аффинная хроматографія. Даний метод полягає в використанні іммобілізованого на матриці специфічного з'єднання - ліганда, здатного специфічно і оборотно зв'язуватися тільки з білками і ферментами, які наближені до даного ліганду. У афінної хроматографії використовують різні нерозчинні сорбенти. Так, все більшого поширення набувають поперечно-зшиті гранули агарози.
Іммуноадсорбція. Абсолютно специфічним адсорбентом для будь-якого ферменту або білка є антитіло до цього білка, яке пов'язане з нерозчинної матрицею. Антитіла мають високу вибірковість тільки до тих білків, проти яких вони були отримані. Тому при використанні іммуноадсорбентов можна отримати препарати ферменту чистіші, ніж при використанні на інших типах афінних адсорбентів.
Фронтально-витіснювальний варіант хроматографії. В цьому випадку використовуються значні зміни коефіцієнтів розподілу і ефективних коефіцієнтів дифузії цільового речовини при «малих» зміни фізико-хімічних властивостей елюіруются розчину.
Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ). Цей вид хроматографії є найважливішим методом аналізу і препаративної поділу біологічно активних речовин. ВЕРХ - це сучасна форма реалізації класичної хроматографії колоночного типу; вона відрізняється можливістю виділяти високоочішенние речовини зі складної суміші, що включають в тому числі і близькі за властивостями компоненти. При цьому в рамках одного хроматографічного експерименту можна отримати ряд високоочі- шенних або індивідуальних компонентів.
До переваг ВЕРХ відносяться:
До недоліків методу ВЕРХ, різко обмежує можливості його широкого використання, слід віднести дорожнечу процесів, що протікають при підвищеному тиску з використанням мікрогранульних сорбентів, а отже, і високу вартість продуктів. Крім того, основні принципи ВЕРХ ускладнюють масштабування процесу, що також обмежує області застосування ВЕРХ.
Існують різні варіанти ВЕРХ.
Нормшьно-фазова хроматографія. При цьому варіанті ВЕРХ рухома фаза менш полярна, ніж нерухома, і основний фактор, що визначає утримування, - це взаємодія сорбат безпосередньо з поверхнею або з внутрішнім об'ємом сорбенту.
Обернено-фазова хроматографія. При цьому варіанті ВЕРХ рухома фаза більш полярна, ніж нерухома, і утримування визначається безпосереднім контактом молекул сорбата з поверхнею або об'ємом сорбенту: при цьому іонізовані сорбат не обмінюється на іони рухомої фази, сорбованих - на поверхні.
Ионообменная хроматографія. При іонообмінної хроматографії сорбція здійснюється шляхом обміну сорбованих іонів рухомої фази на іони хроматографіруемого речовин. Аналогічним чином можна визначити лігандообменную хроматографію.
Хроматографія на динамічно модифікованих сорбентах. Це варіант ВЕРХ, при якому сорбат не взаємодіє безпосередньо з поверхнею сорбенту, а вступає в асоціацію з молекулами поверхневих шарів елюента. Склад цих шарів, що знаходяться в динамічній рівновазі з рухомою фазою, відрізняється від середнього для даного експерименту складу рухомої фази.
Іон-парна хроматографія. Це такий варіант обернено-фазової хроматографії іонізованих з'єднань, при якому в рухому фазу додається гідрофобний противоион, якісно змінює сорбційні характеристики системи.
Ексиюзіонная хроматографія. Це спосіб поділу з'єднань по їх молекулярним масам, заснований на відмінності в швидкості дифузії в порах нерухомої фази молекул різних розмірів.
Розглянемо докладно найбільш поширені види ВЕРХ.
В даний час з усіх варіантів ВЕРХ найбільш широко застосовується обернено-фазова. Її перевага визначається методичної простотою і універсальністю, у багатьох випадках - простотою механізму сорбції.
термін обернено-фазова хроматографія ввів А. Мартін в 1950 р На відміну від інших, що раніше застосовувалися систем розподільної хроматографії, тут нерухома фаза менш полярна, ніж рухлива, що, власне, і послужило приводом до такої назви.
Основними досягненнями сучасної обернено-фазової ВЕРХ як методу поділу білків є розробка нерухомих фаз з великим розміром пор (більше 10 нм). Ці фази мають велику селективність і забезпечують великий вихід продукту. Відмінні хроматограми отримані на нерухомій фазі на основі силікагелю з порами розміром 33 нм. На цих колонках були розділені такі високомолекулярні білки, як колаген, сироватковий альбумін, овальбумин, ланцюги фібриногену, молекулярна маса більшості з'єднань складала від 40 до 300 kDa. Вихід білкового компонента досягав 85%.