| Головна |
| «« | ЗМІСТ | »» |
|---|
Клон вірусу або клітин - це якась популяція, кожен член якої веде походження від одного репродукується віріона або від однієї клітини відповідно. Всі члени клону незалежно від того, чи є вони вірусами або клітинами, по суті, ідентичні вірусу або клітці, які дали початок клону; вони також ідентичні один одному. За допомогою клонування отримують чистий препарат одного генома, оскільки всі члени клону містять ідентичні ДНК. Ця концепція молекулярного клонування використовується і при отриманні чистих препаратів певних молекул рекомбінантних ДНК.
В основі молекулярного клонування лежить вбудовування потрібного фрагмента ДНК (вставки) в іншу молекулу ДНК (вектор), яка здатна переносити в клітку чужорідну ДНК і забезпечувати там її амплификацию. Як векторів найчастіше використовують бактеріальні плазміди, бактеріофаги і віруси тварин. Плазміди є кільцеві молекули двухцепочечной ДНК, що зустрічаються в клітинах бактерій і дріжджів, де вони реплікуються в процесі проліферації клітин як самостійні одиниці.
При роботі з Е. coli найчастіше використовують плазмиду pBR322 (рис. 15.5). Цей вектор був сконструйований за допомогою класичних генетичних методів (in vivo) і методів, що застосовуються при роботі з рекомбінантними ДНК, і має багато властивостей ідеального плазмідної вектора д ля клонування. Встановлено повна нуклеотидних послідовність цього вектора. Крім того, плазмида містить два селективних маркера: гени стійкості до ампіциліну і тетрацикліну. Кожен з 12 сайтів впізнавання рестріктазамі зустрічається в молекулі лише 1 раз, і це дозволяє отримувати повнорозмірні лінійні молекули з різноманітними «липкими кінцями». У нормі в клітці Е. coli може міститися до 50 копій плазміди pBR322. клітини Е. coli, містять даний вектор, вирощують в середовищі з ампіциліном або тетрацикліном, на якій клітини, що не мають цю плазміду, не ростуть. Таким чином, на такий селективної середовищі накопичуються тільки ті клітини, які містять рекомбінантний ДНК. Це властивість полегшує виділення великих кількостей рекомбінантної плаз- мідно ДНК.
Мал. 15.5. Схема будови плазмідної вектора pBR322: ori - точка початку реплікації; Атт Ті г - гени стійкості до ампіциліну і тетрацикліну; R - реплікон; / ?; Pu, Е, Я ...- сайти рестрикції різних рестриктаз (цифри позначають число нуклеотидних пар)
Звичайний розмір плазміди - 3-10 тис. Нуклеотидних пар. Деякі плазміди мають ще однією важливою особливістю: якщо на клітини, в яких присутній такий вектор, подіяти антибіотиком хло- рамфеніколом, то число копій плазміди в них зросте від декількох штук до 3 000. При цьому збільшується доза потрібного гена, що дозволяє отримувати вставлений в плазмиду ген (або продукт цього гена) у великих кількостях. У плазмиду можна вставляти фрагменти чужорідної ДНК розмірами не більше 10-15 тис. Пар нуклеотидів.
Коли потрібно клонувати більші фрагменти ДНК, зручніше використовувати вектори на основі помірного бактеріофага X.
Генетична карта фага X дикого типу із зазначенням сайтів рестрикції для рестриктаз представлена на рис. 15.6. Молекула ДНК фага X містить область почала реплікації, а також гени структурних вірусних білків (головки і хвостового відростка) і ферментів, які беруть участь в реплікації ДНК, лизисе інфікованих клітин і встановленні лизогении. Фаг X дуже пластичний: без порушення розвитку фага з нього можна прибрати до 25% ДНК або прибудувати до 6% зайвої ДНК. В цей фагів вектор можна вбудовувати до 23 тис. Нуклеотидних пар.
Мал. 15.6. Лінійний геном бактеріофага X: світлий овал - область почала реплікації; Р-Есона - сайти; заштрихована частина - гени, необов'язкові для литичної інфекції
Плазміди і бактеріофаги - найбільш часто використовувані вектори. Але існують і інші типи векторів зі своїми перевагами. Перш за все це косміди - вектори, отримані шляхом об'єднання невеликих фрагментів бактеріофага X і плазмід. Вони містять гени, що дозволяють їм розмножуватися в бактерії, ген стійкості до тетрацикліну і особлива ділянка ДНК з бактеріофага X під назвою COS, який містить все необхідне для упаковки рекомбінантної ДНК в білкову головку фага. Косміди дозволяють отримувати гібридні молекули з довжиною вставки в 35-40 тис. Пар нуклеотидів.
За допомогою косміди і всіх вищеназваних векторів гени вводять в бактеріальні клітини. Для клітин тварин і людини вони непридатні. Справа в тому, що молекулярні механізми реалізації генетичної інформації у прокаріотів і еукаріотів різні, і бактеріальна плазмида не здатна розмножуватися в тваринній клітині.
Як векторів тварин і людини використовуються різні віруси. Так, вектор на основі вірусу SV40 збільшує число введених генів до 100 тис. Молекул на клітину. Застосовують вектори на основі вірусів папіломи, герпесу, осповакціни, адено- і ретровірусів. Особливість структури ретровируса - наявність довгих кінцевих повторів на кінцях молекули ДНК-вірусу. Ці повтори і дають можливість гібридної молекулі вбудуватися в хромосому клітини-господаря.