Головна
Cоціологія || Гуманітарні науки || Мистецтво та мистецтвознавство || Історія || Медицина || Науки про Землю || Політологія || Право || Психологія || Навчальний процес || Філософія || Езотерика || Екологія || Економіка || Мови та мовознавство
ГоловнаМедицина → генетика
««   ЗМІСТ   »»

ВИЗНАЧЕННЯ НУКЛЕОТИДНИХ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ (СЕКВЕНУВАННЯ)

Встановлення первинної структури - нуклеотидноїпослідовності клонованого сегмента ДНК - необхідно для з'ясування його структури, функції і походження.

Є дві категорії методів секвенування ДНК. В основі методів першої категорії лежать хімічні реакції, в яких використовують безпосередньо фрагменти очищеної ДНК. У другому випадку використовують ДНК-копії очищених сегментів, отримані ферментативним шляхом. Ці підходи мають деяку схожість:

Метод хімічного секвенування заснований на специфічній модифікації різних пуринових і піримідинових основ. Ці модифіковані підстави вищепляются потім з полімеразної ланцюга зі збереженням сахарофосфатнимі остова. Далі гидролизуют щодо нестабільні фосфодіефірні зв'язку, що є сусідами з сайтом, де знаходилося віддалене модифіковане підставу, в результаті чого ланцюг розривається (рис. 15.7).

На рис. 15.8 представлена схема хімічного методу секвенування ДНК. Вихідний фрагмент ДНК, мічений 32Р по 5'-кінця, піддається специфічному розщепленню за певним нуклеотиду (наприклад, А), в результаті чого утворюються радіоактивні фрагменти різної довжини, які поділяються за розмірами при гель-електрофорезі, а радіоактивні з них виділяються за допомогою радиоавтографии.

Схема отримання сімейства мічених по 5'-концу фрагментов ДНК в результате расщепления по определенному нуклеотиду (А)

Мал. 15.8. Схема отримання сімейства мічених по 5'-кінця фрагментів ДНК в результаті розщеплення за певним нуклеотиду (А)

Ензиматичний метод секвенування заснований на ензиматичну введенні нуклеотиду, терминирующего полінуклеотидних ланцюг (рис. 15.9). В цьому випадку зазвичай використовують дідезоксірібонуклеозідтріфосфати, в яких дезоксирибоза-З'-ОН, представлена в нормальних нуклеотидах, відсутня. Такий модифікований нуклеотид, проникаючи в ланцюг ДНК за допомогою ДНК-полімерази, блокує приєднання наступного нуклеотиду. синтез in vitro молекули ДНК в присутності затравки (праймера) і невеликої кількості одного з таких модифікованих нуклеотидів призводить до утворення фрагментів ДНК у вигляді «драбинки». Якщо для отримання таких фрагментів застосовувати мічену ДНК (зазвичай проводять чотири реакції синтезу з використанням різних нуклеотидів, терминирующего ланцюг), а електрофоретичний аналіз проводити на чотирьох доріжках гелю, то можна визначити послідовність нуклеотидів.

В даний час використовують модифікований метод, що зводиться до флуоресцентного аналізу наборів фрагментів ДНК в процесі руху по одній доріжці гелю.

Схема ензиматичного методу секвенування нуклеїнових кислот, заснованого на ензиматичну введенні нуклеотиду, терминирующего ланцюг

Мал. 15.9. Схема ензиматичного методу секвенування нуклеїнових кислот, заснованого на ензиматичну введенні нуклеотиду, терминирующего ланцюг: а - синтез in vitro в присутності затравки з утворенням «драбинки» фрагментів; б - інкубація чотирьох по-різному пофарбованих флуоресціюючих запалів в суміші нуклеотидів з додаванням різних дідНТФ, які припиняють зростання ланцюга (А, Т, Ц, Г)

Робота по визначенню нуклеотиднихпослідовностей великих геномів, що складаються з мільйонів і більше нуклеотидів, значно полегшується, оскільки існують комп'ютерні програми, за допомогою яких можна швидко знайти перекриваються послідовності в аналізованих фрагментах, а потім скласти повну карту геному.

  1. Вплив різних чинників на хімічну рівновагу - біохімія людини
    Принцип Ле Шательє. Рівняння ізотерми реакції (5.19) дозволяє прогнозувати зміну константи швидкості реакції і відповідно зсув рівноваги при зміні концентрації певної речовини або температури. Якщо в систему зі сталим хімічним рівновагою додати будь-якої з реагентів, наприклад А, то концентрація
  2. Вплив на процес старіння способу життя - біологія. Частина 1
    поняття способу життя в строгому сенсі може бути застосовано лише до людини, так як включає в себе усвідомлене ставлення до власних дій і, отже, залишає за індивідуумом право вибору чинити так чи інакше. У повсякденному житті спосіб життя нерідко як би нав'язується людям зовнішніми обставинами
  3. Вплив концентрації ферменту, вплив концентрації субстрату - біохімія
    За умови надлишку субстрату швидкість реакції прямо пропорційна концентрації ферменту: де і - швидкість реакції; | Е | - концентрація ферменту; до - константа швидкості реакції. На рис. 6.4 представлено вплив концентрації ферменту аргінази на швидкість розщеплення аргініну. Відхилення від
  4. Вогнищева вузлова гіперплазія - факультетська хірургія
    Вогнищева вузлова (фокально-нодулярна) гіперплазія - доброякісне новоутворення, що характеризується локальної гіперплазією печінкової паренхіми з фіброзними прошарками. Найчастіше виявляється у жінок, при цьому відзначається зв'язок з вживанням гормональних контрацептивів і підвищенням рівня
  5. Внутрішня рецепція (вісцерорецепція) - анатомія центральної нервової системи
    Вісцерорецептори - це частина интерорецепторов, які знаходяться у внутрішніх органах і кровоносних судинах. Завдяки вісцерорецеп- Торам організм отримує безліч інформації, необхідної для підтримки гомеостазу, т. Е. Сталості внутрішнього середовища. Так, в результаті діяльності Вісцерорецептори
  6. Внутрішньоклітинний обмін вуглеводів, загальна характеристика - біохімія
    У всіх клітинах, здатних метаболизировать глюкозу, першою реакцією є її фосфорилювання до глюкозо-6-фосфату. Реакція каталізується ферментом гексокінази, а донором фосфорильної групи є молекула АТФ: Ця реакція практично необоротна, AG ° ' = -16,74 кДж / моль. Гексокі- наза, яка присутня в
  7. Властивості нервових центрів - ендокринна і центральна нервова системи, вища нервова діяльність, аналізатори, етологія
    Нервовим центром називається сукупність нейронів, необхідних для здійснення певного рефлексу. З фізіологічної точки зору нервовий центр - це складне поєднання нейронів, узгоджено і координовано беруть участь в регуляції функцій і рефлекторної реакції. Нервові центри мають ряд характерних
  8. Визначення третинної і четвертинної структур білків - біохімія
    Третинна і четвертинна структури білків визначаються за допомогою рентгеноструктурного аналізу, який вперше був прознавств стосовно міоглобіну і гемоглобіну Дж. Кендра і М. Перутца в Кембриджі. Значення рентгеноструктурного аналізу білків важко переоцінити, оскільки саме цей метод дав можливість
© 2014-2022  ibib.ltd.ua