ВИЗНАЧЕННЯ НУКЛЕОТИДНИХ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ (СЕКВЕНУВАННЯ)
Встановлення первинної структури - нуклеотидноїпослідовності клонованого сегмента ДНК - необхідно для з'ясування його структури, функції і походження.
Є дві категорії методів секвенування ДНК. В основі методів першої категорії лежать хімічні реакції, в яких використовують безпосередньо фрагменти очищеної ДНК. У другому випадку використовують ДНК-копії очищених сегментів, отримані ферментативним шляхом. Ці підходи мають деяку схожість:
фрагменти ДНК очищають за допомогою клонування;
за один раз секвеніруют тільки один ланцюг ДНК, позначену радіоактивним ізотопом, і визначають її нуклеотидную послідовність;
утворюється набір радіоактивно мічених одиночних ланцюгів всіх можливих довжин - від 1 до п (І - повна довжина секвенируемой молекули).
Метод хімічного секвенування заснований на специфічній модифікації різних пуринових і піримідинових основ. Ці модифіковані підстави вищепляются потім з полімеразної ланцюга зі збереженням сахарофосфатнимі остова. Далі гидролизуют щодо нестабільні фосфодіефірні зв'язку, що є сусідами з сайтом, де знаходилося віддалене модифіковане підставу, в результаті чого ланцюг розривається (рис. 15.7).
На рис. 15.8 представлена схема хімічного методу секвенування ДНК. Вихідний фрагмент ДНК, мічений 32Р по 5'-кінця, піддається специфічному розщепленню за певним нуклеотиду (наприклад, А), в результаті чого утворюються радіоактивні фрагменти різної довжини, які поділяються за розмірами при гель-електрофорезі, а радіоактивні з них виділяються за допомогою радиоавтографии.
Мал. 15.8. Схема отримання сімейства мічених по 5'-кінця фрагментів ДНК в результаті розщеплення за певним нуклеотиду (А)
Ензиматичний метод секвенування заснований на ензиматичну введенні нуклеотиду, терминирующего полінуклеотидних ланцюг (рис. 15.9). В цьому випадку зазвичай використовують дідезоксірібонуклеозідтріфосфати, в яких дезоксирибоза-З'-ОН, представлена в нормальних нуклеотидах, відсутня. Такий модифікований нуклеотид, проникаючи в ланцюг ДНК за допомогою ДНК-полімерази, блокує приєднання наступного нуклеотиду. синтез in vitro молекули ДНК в присутності затравки (праймера) і невеликої кількості одного з таких модифікованих нуклеотидів призводить до утворення фрагментів ДНК у вигляді «драбинки». Якщо для отримання таких фрагментів застосовувати мічену ДНК (зазвичай проводять чотири реакції синтезу з використанням різних нуклеотидів, терминирующего ланцюг), а електрофоретичний аналіз проводити на чотирьох доріжках гелю, то можна визначити послідовність нуклеотидів.
В даний час використовують модифікований метод, що зводиться до флуоресцентного аналізу наборів фрагментів ДНК в процесі руху по одній доріжці гелю.
Мал. 15.9. Схема ензиматичного методу секвенування нуклеїнових кислот, заснованого на ензиматичну введенні нуклеотиду, терминирующего ланцюг: а - синтез in vitro в присутності затравки з утворенням «драбинки» фрагментів; б - інкубація чотирьох по-різному пофарбованих флуоресціюючих запалів в суміші нуклеотидів з додаванням різних дідНТФ, які припиняють зростання ланцюга (А, Т, Ц, Г)
Робота по визначенню нуклеотиднихпослідовностей великих геномів, що складаються з мільйонів і більше нуклеотидів, значно полегшується, оскільки існують комп'ютерні програми, за допомогою яких можна швидко знайти перекриваються послідовності в аналізованих фрагментах, а потім скласти повну карту геному.
Вплив різних чинників на хімічну рівновагу - біохімія людини Принцип Ле Шательє. Рівняння ізотерми реакції (5.19) дозволяє прогнозувати зміну константи швидкості реакції і відповідно зсув рівноваги при зміні концентрації певної речовини або температури. Якщо в систему зі сталим хімічним рівновагою додати будь-якої з реагентів, наприклад А, то концентрація
Вплив на процес старіння способу життя - біологія. Частина 1 поняття способу життя в строгому сенсі може бути застосовано лише до людини, так як включає в себе усвідомлене ставлення до власних дій і, отже, залишає за індивідуумом право вибору чинити так чи інакше. У повсякденному житті спосіб життя нерідко як би нав'язується людям зовнішніми обставинами
Вплив концентрації ферменту, вплив концентрації субстрату - біохімія За умови надлишку субстрату швидкість реакції прямо пропорційна концентрації ферменту: де і - швидкість реакції; | Е | - концентрація ферменту; до - константа швидкості реакції. На рис. 6.4 представлено вплив концентрації ферменту аргінази на швидкість розщеплення аргініну. Відхилення від
Вогнищева вузлова гіперплазія - факультетська хірургія Вогнищева вузлова (фокально-нодулярна) гіперплазія - доброякісне новоутворення, що характеризується локальної гіперплазією печінкової паренхіми з фіброзними прошарками. Найчастіше виявляється у жінок, при цьому відзначається зв'язок з вживанням гормональних контрацептивів і підвищенням рівня
Внутрішня рецепція (вісцерорецепція) - анатомія центральної нервової системи Вісцерорецептори - це частина интерорецепторов, які знаходяться у внутрішніх органах і кровоносних судинах. Завдяки вісцерорецеп- Торам організм отримує безліч інформації, необхідної для підтримки гомеостазу, т. Е. Сталості внутрішнього середовища. Так, в результаті діяльності Вісцерорецептори
Внутрішньоклітинний обмін вуглеводів, загальна характеристика - біохімія У всіх клітинах, здатних метаболизировать глюкозу, першою реакцією є її фосфорилювання до глюкозо-6-фосфату. Реакція каталізується ферментом гексокінази, а донором фосфорильної групи є молекула АТФ: Ця реакція практично необоротна, AG ° ' = -16,74 кДж / моль. Гексокі- наза, яка присутня в
Визначення третинної і четвертинної структур білків - біохімія Третинна і четвертинна структури білків визначаються за допомогою рентгеноструктурного аналізу, який вперше був прознавств стосовно міоглобіну і гемоглобіну Дж. Кендра і М. Перутца в Кембриджі. Значення рентгеноструктурного аналізу білків важко переоцінити, оскільки саме цей метод дав можливість
