Головна
Cоціологія || Гуманітарні науки || Мистецтво та мистецтвознавство || Історія || Медицина || Науки про Землю || Політологія || Право || Психологія || Навчальний процес || Філософія || Езотерика || Екологія || Економіка || Мови та мовознавство
ГоловнаМедицина → генетика
««   ЗМІСТ   »»

ОТРИМАННЯ ГЕНІВ

Перший успішний експеримент по виділенню гена, точніше, групи генів лактозного оперона (/ ас-оперону) Е. coli був виконаний в 1969 р в лабораторії Дж. Беквита. Для цього використовували два трансдуцірующіх бактеріофага X і Р80, які включили / ас-оперон в свої геноми в протилежної орієнтації по відношенню до власних генам. Оскільки підхід до виділення / ас-оперону вельми специфічний для бактерії Е. coli, його змінили інші прийоми, що застосовуються в роботі з будь-якими організмами.

Послідовності, впізнавані рестріктазамі, стохастично розкидані по геному. Чим коротше послідовність, тим частіше вона зустрічається, відповідно, тим коротше фрагменти ДНК, які утворюються при рестрикції. Ферменти рестрикції можна розділити на їхню молекулярної масі і заряду за допомогою електрофорезу в гелі. В даний час з різних мікроорганізмів виділено безліч ресгріктаз з неоднаковою специфічністю по відношенню до нуклеотидних послідовностей ДНК.

Пошук потрібного гена серед суміші рестрикційних фрагментів представляє певні складності. Поряд з цим найбільш поширеним способом отримання генів існує також спосіб хімічного синтезугенів.

Хімічний і ензиматичний синтез генів має певні переваги перед їх пошуком серед рестрикційних фрагментів. Ці методи мають і недоліки, оскільки синтетичні гени найчастіше позбавлені низки регуляторних елементів, необхідних для їх повноцінної експресії.

Клонують фрагмент ДНК може бути обмежено розмножений в ході клітинних поділів трансформанта. Вектори типу плазміди pBR322 називають векторами інактивації.

Здатність ДНК вірусу 5К40 вбудовувати в свою молекулу чужу ДНК була вивчена при отриманні гібридної молекули ДНК з двох вірусів, один з яких - онкогенний вірус SV40, а другий - дефектний фаг X з включеним в нього галактозним опероном Е. coli (Рис. 15.12). рестріктаза EcoRl розрізає кільцеві молекули вірусів в строго визначеному місці. Це переводить молекули обох вірусів з кільцевого стану в лінійне. Під дією ферменту екзонуклеаза однонітевиє ділянки розширюються на обох кінцях кожної з двох лінійних молекул. За допомогою ферменту кінцевий трансферази нарощуються кінцеві ділянки полі- (?? 4) і полі- (оТ). Тим самим створюються комплементарні однонітевиє кінці для обох молекул. Підготовлені таким чином молекули з'єднуються в кільце. Потім, застосовуючи обробку ДНК-полімеразою, забудовують однонітевиє ділянки по комплементарних матриць і за допомогою ДНК-лігази замикають гібридні кільця ковалентними зв'язками.

В результаті галактозна оперон До coli виявляється включеним в ДНК вірусу 5У40.

Отримання гібридної молекули з вірусу SP40 і ДНК фага X, несучої галактозна оперон бактерії?. coli

Мал. 15.12. Отримання гібридної молекули з вірусу SP40 і ДНК фага X, несучої галактозна оперон бактерії?. coli

Серед ферментів в роботах з генної інженерії головне місце займають рестріктірующіе ендонуклеази, що дозволяють отримати однорідні фрагменти ДНК, і лігази, що зшивають фрагменти. Фрагменти рестрикції кодуються хромосомними і плазмідними генами.

При розрізуванні дволанцюжкових молекул ДНК кінці фрагментів за місцем розриву можуть зберігати двухцепочечную структуру (так звані тупі кінці). ДНК-лігаза фага Т4 здатна з'єднувати тупі кінці молекул ДНК.

Для полегшення процесу зшивання на обох тупих кінцях розрізаної молекули ферментативно можна наростити липкі кінці. Такі липкі кінці, що виникають в місці розрізу двухцепочечной ДНК, здатні з'єднуватися не тільки між собою, відновлюючи вихідну кільцеву молекулу ДНК. Вони з'єднуються з будь-яким іншим фрагментом чужорідної ДНК, які мають липкі кінці, отримані при дії тієї ж рестріктази. При додаванні ферменту полінуклеотідлігази це з'єднання набуває міцний ковалентний характер. Рекомбінантна плазмида з включеним в неї ділянкою чужорідної ДНК стає тазмідним вектором. Введення в клітку і подальше розмноження рекомбінантної плазміди забезпечують клонування придбаного нею чужорідного фрагмента ДНК.

Поряд з рекстріктазамі і лігази робота по рекомбінантним молекулам вимагає цілого банку ферментів, таких як нукпеази, зворотна транскриптаза, термінальна нуклеотідінтрансфераза, ДНК-полімераза I і ін. Всі ці ферменти відонеспеціфічни, що дозволяє створювати рекомбінантні плазміди, що поєднують генний матеріал від будь-яких органічних форм.

  1. Переробка інформації нейронами сітківки - вікова анатомія і фізіологія
    Фоторецептори з'єднуються через біполярні нейрони з гангліозними клітинами. Аксони гангліозних клітин утворюють зоровий нерв, по якому від сітківки до головного мозку передається зорова інформація. У сітківці є також вставні нейрони, що здійснюють горизонтальні взаємодії клітин. Одні (горизонтальні
  2. Перекриваються гени - генетика в 2 Ч. Частина 1
    У деяких вірусів виявлені перекриваються гени. Так, у ряду РНК-содсржашіх бактеріофагів Е. coli (R17, f2, MS2 і ін.) Були встановлені і вивчені три гена: контролюючі синтез реплікази і білка оболонки, а також дозрівання вірусної частинки. Після розшифровки повної нуклеотидної послідовності
  3. Передопераційна підготовка хворих - сестринська справа в хірургії
    Передопераційний період - це час від моменту надходження хворого в хірургічний стаціонар до початку проведення оперативного лікування. Основна задана передопераційної підготовки - зниження операційного ризику і створення оптимальних передумов для успішного результату. Передопераційна підготовка
  4. Передмова - сестринська справа в хірургії
    У підручнику з урахуванням вимог Федерального державного освітнього стандарту вищої освіти від 3 вересня 2015 р № 964, обов'язкових при реалізації основних професійних освітніх програм вищої освіти - програм бакалаврату за напрямом підготовки «Сестринська справа», представлений матеріал по
  5. Передмова - біохімія людини
    Курс входить до циклу «Загальні математичні та природничі дисципліни». Основні цілі дисципліни: формування кількісних фізико-хімічних методів оцінки ролі біохімічних процесів при проектуванні і експлуатації біотехнічних систем для розробки методів контролю, діагностики, терапії і управління
  6. Пентозомонофосфатний шлях - біохімія
    Альтернативним гликолизу окислювальним шляхом катаболізму гексоз є пентозомонофосфатний, або пентозний шлях. Оскільки при цьому глюкозо-6-фосфат вимикається з метаболічного перетворення шляхом гліколізу, його також називають гексозомонофосфатного шунтом. Пентозний шлях широко поширений в природі
  7. Патофізіологія холелітіаза - сестринська справа в хірургії
    Розрізняють два типи жовчних каменів: холестеринові камені і пігментні камені. Холестеринові камені повністю складаються з холестерину або ж вони містять понад 90% холестерину, 2-3% кальцієвих солей і 3-5% пігментів, причому білірубін зазвичай знаходиться у вигляді невеликого ядра в центрі
  8. Оцінка результатів лікування і документування - сестринська справа в хірургії
    Після припинення епізодів гострого болю медсестра проводить оцінку реакції хворого на прийом їжі. У пацієнта після прийому їжі не повинно бути болі. Медсестра оцінює переваги хворого в їжі і порівнює їх з запропонованої дієтою. Точна документація історії хвороби пацієнта і наявних у нього
© 2014-2021  ibib.ltd.ua