| Головна |
| «« | ЗМІСТ | »» |
|---|
До другої половини 1940-х рр. вважаюся, що гени стабільно розташовуються в певних локусах відповідних хромосом і не здатні переміщатися з одного положення в інше без реципрокного обміну
У 1951 р Барбара Мак-Клінток, співробітниця Вашингтонського інституту Карнегі, вперше описала рухливі генетичні елементи, виявлені у кукурудзи, які вдалося виявити завдяки їх здатності переміщатися з одного сайту в інший. Вона назвала їх контролюючими елементами. Впровадження контролюючого елемента в певний сайт впливає на активність і суміжних генів.
У дослідах з генетики забарвлення зерна кукурудзи Б. Мак-Клінток отримала факти, які не можна було пояснити з позиції стабільної локалізації генів в хромосомах і нездатності їх до переміщення в геномі: в дослідах були виявлені рослини-близнюки, що мають неоднакову забарвлення листя (у одного вони були інтенсивно-зеленим, в іншого - світло-жовтими). Аналогічне явище проявилося і в забарвленні насіння в качанах. Результати досвіду свідчили про наявність у одного з дочірніх рослин специфічної генетичної системи, якій інша рослина не володіло.
Отримані експериментальні дані дозволили Б. Мак-Клінток довести наявність рухомих генетичних елементів в хромосомах кукурудзи і розробити чітку модель генетичної системи, яка взаємодіє з генами, що визначають пігментацію зерен в качані і інтенсивність забарвлення листя рослини. Ця система включає два рухомих контролюючих елемента: диссоциатор, названий /) $ - геном, і активатор - Ас-ген. Генетична система працює таким чином: якщо Ds-ген пересувається до хромосомному ділянці, розташованому поруч зі структурним геном (наприклад, контролюючим візерунок чергування смуг на листі кукурудзи), то він пригнічує фенотипічну експресію структурного гена, в результаті чого смуги на листках стають бляклими. Однак це придушення ефективно лише в тому випадку, коли ген Ас знаходиться біля двох названих вище генів. Якщо ж ген Ас переміщається на більш віддалений ділянку хромосоми, придушення геном Ds структурного гена не відбувається і поздовжні смуги на листках яскраво-зелені. Згідно з висновками Б. Мак-Клінток, один з двох мобільних генів (Ds) пригнічує дію довколишнього структурного гена, а інший (Ас) знімає цю дію.
За сучасною класифікацією ген Ас відноситься до класу автономних контролюючих елементів, які здатні вирізатися з хромосоми і транспозіроваться; їх впровадження в новий сайг веде до появи нестабільних алелей т (mutable). ген Ds є неавтономним контролюючим елементом, який втрачає свою стабільність тільки в тому випадку, якщо в якійсь області генома присутня автономний член того ж сімейства. Неавтономний елемент може комплементіроваться в / я / юнс-положенні автономним і здійснювати властиві йому функції. Встановлено, що неавтономні елементи можуть бути активізовані в т /? яіс-положенні тільки певними автономними елементами.
На кукурудзі були описані два типи систем переміщаються генетичних елементів. У простій одноелементної системі мобільний контролюючий елемент впливає на активність гена, який прилягає до нього в хромосомі. У разі двоелементною системи існують:
Виявлено та вивчено цілий ряд двоелементний систем: зокрема, для рецепторів I; Ds; dt; сі; ruq з регуляторами відповідно: Еп, Spm; Ас, Мр; Dr, Feu; Spfi Uq; наприклад, система Ds-Ac (Дисоціації-активації), система Spm (Супресор-мутатор) і ін.
В термінологію, пов'язану з вивченням мобільних генетичних систем, внесені суттєві доповнення. Зокрема, введено поняття «транспозиція», «транспозон (и)», «інсерційні послідовності» та ін.
транспозиція - це переміщення сегмента ДНК з одного пункту до іншого без реципрокного обміну.
транспозон - це транспозіруемая послідовність ДНК, що несе один або кілька генів, обмежена з обох сторін ідентичними ін- серціоннимі послідовностями, які забезпечують транспозони здатність переміщатися з одного локусу в інший.
Інсерційні послідовності називаються різні послідовності нуклеотидів, виявлені в бактеріях і здатні до переміщення з одного хромосомного локусу в інший. Спонтанне переміщення таких послідовностей може викликати мутації в вихідному або новій ділянці впровадження. Ці послідовності можуть внести активні промотори або термінатори синтезу мРНК і служити участкамі- мішенями для інтеграції Епіс.
Відкриття Б. Мак-Клінток транспозірующіх генетичних систем і генетичної регуляції мало величезне наукове значення. Відкриття мігруючих генетичних елементів і модель генетичної системи дозволяли також правильно інтерпретувати деякі явища, несумісні зі строгими менделевскими законами спадковості, за якими фенотипічні ознаки від будь-яких двох батьків розподіляються у нащадків відповідно до генетичної домінантністю або рецесивних в простих співвідношеннях. За допомогою цієї моделі можна було пояснити і механізм зміни колірного візерунка кукурудзяного качана при переході від ранніх стадій розвитку рослини до пізніх. Мак-Клінток висловила також ідею про те, що рухливі генетичні елементи або гени можуть впливати на швидкість виникнення нових видів рослин і тварин.
Крім того, модель системи дозволила пояснити, яким чином резистентність до антибіотиків передається від одного виду бактерій до інших, що мало велике практичне значення.
До теперішнього часу зібрано величезний експериментальний матеріал, отриманий на різних об'єктах, про мобільних генетичних елементах, здатних до переміщення в межах генома і поза ним. Він показує, наскільки велика еволюційна роль перебудов і дуплікацій послідовностей ДНК. І хоча структура генома цілком стабільна, зустрічаються, хоч і рідко, транспозиції послідовностей ДНК з одного геномного локусу в інший або дуплікації з подальшою ампліфікацією сегментів ДНК. Вбудовування мобільного сегменту в новий геномної локус супроводжується зміною кодує ділянки або важливого регуляторного елемента. У найпростішому випадку ген перестає експресуватися. Але нерідко самі мобільні елементи виконують регуляторні функції. У таких випадках експресія генів, що є сусідами зі вставкою, може зазнати складні зміни, в тому числі і з переходом на нові способи регуляції.
Розрізняють декілька типів мобільних ДНК-елементів. За класифікацією, заснованої насамперед на структурні особливості елементів, виділяють:
У деяких ретротранспозонов, званих рстротранспозонамі класу I, цей центральний сегмент оточений довгими кінцевими повторами (LTR). У ретротранспозонов класу I на одному з кінців є також короткі інвертовані повтори. За своєю структурою, особливостями транскрипції і механізму транспозиції вони нагадують ретровірусних провіруси. Відмінність полягає у відсутності життєздатних позаклітинних форм. Сімейства ретротранспозонов виявлені у різних безхребетних, зокрема у дріжджів і дрозофіли, а також у рослин і деяких ссавців.
Ретротранспозонов класу П не мають кінцевих повторів, а один з кінців часто буває представлений багатою АТ послідовністю. В цьому відношенні вони не схожі на ретровірусних провіруси. Елементи класу П менш вивчені, ніж елементи класу I, хоча вони широко поширені серед еукаріот.
Ретрогени - переміщаються по геному різноманітні сегмеши ДНК, що не володіють специфічними структурними і кодують властивостями транспозони або ретротранспозонов. На відміну від мобільних елементів інших класів вони гетерогенні за розміром і структурою. У них немає кінцевих повторів, а на одному з кінців часто присутня багата АТ послідовність. До ретрогенія відносяться процессірованной псевдогени і SINE-послідовності (довгі дисперговані повтори у ссавців); вони виявлені у різних еукаріот, але особливо широко представлені у ссавців. Вважають, що транспозиція ретрогенія відбувається через освіту РНК з подальшою зворотною транскрипцією. При цьому ретрогени не кодують необхідних для транспозиції активностей (т. Е. Зворотний транскриптазу).
При вивченні рухомих генетичних елементів виділяють плаз- мідно або векторну трансформацію. Цей процес пов'язаний з введенням в клітини бактерій генів еукаріот, інтегрованих в природні або штучні плазміди. Останні являють собою нехромосомнис генетичнідетермінанти бактерій і еукаріот, що об'єднуються в більш широку групу - плазміди. Оскільки F-фактор та інші епісоми можуть реплицироваться автономно, т. Е. Незалежно від бактеріальної хромосоми, їх також відносять до плазміди. плазміди - кільцеві молекули ДНК, що володіють властивостями реплікону, т. е. вони можуть реплицироваться за допомогою ферментів клітини бактерії незалежно від основної хромосоми.
Експерименти з реконструкції клітин відкрили нові перспективи як для вивчення біології клітини, так і для розробки нових методів терапії на клітинному рівні. Ідентифікація ДНК як трансформує агента стимулювала спроби трансформації її у тварин, рослин та інших еукаріотичних організмів. В кінці 1970-х рр. були отримані відтворювані результати із застосуванням векторної трансформації. В основі цього підходу лежить використання векторних молекул, або векторів, в якості яких застосовували плазміди спочатку бактеріальних, потім еукаріотів. вектори - це молекули ДНК, здатні переносити включені в них гени в клітку, де ці молекули реплікуються автономно або після інтеграції з геномом.
Важливу роль в експериментах зіграли також методи клонування індивідуальних генів, т. Е. Їх напрацювання в потрібних кількостях шляхом необмеженого розмноження в бактеріальних клітинах. В ході розробки цих процедур була створена високоефективна техніка генної інженерії, що включає: виділення індивідуальних фрагментів ДНК будь-якого походження, їх стабільне відтворення в складі векторів, ідентифікацію функцій клонованих генів, їх зміна і введення в клітини вихідного чи іншого організму. Ця так звана техніка рекомбінантних ДНК в поєднанні з методами розшифровки первинної структури генів відкрила можливість експериментування безпосередньо на генетичному матеріалі, маніпулювання генами в наукових і практичних цілях.
В основі молекулярного клонування лежить вбудовування потрібного фрагмента ДНК (вставки) в іншу молекулу ДНК (вектор), яка здатна реплицироваться у відповідній клітині-хазяїні. Таке вбудовування здійснюють in vitro, а потім утворилися рекомбінантні молекули ДНК вводять в клітини. Векторна молекула повинна містити точку початку реплікації (Ori). Крім того, для реплікації потрібні специфічні ферменти і інші білки; їх поставляє клітина-господар, або вони кодуються самим вектором. Вектором може бути будь-який невеликий внехро- мосомний елемент, наприклад плазмида, ДНК фага або вірусу. Основним принципом молекулярного клонування завжди є створення двокомпонентної системи - сумісної комбінації господаря і вектора.
Як правило в таких комбінаціях в ролі господаря виступає штам Е. coli К12, а в ролі вектора - плазміди Е. coli і фаги. Перевага, що віддається штаму К12, обумовлено тим, що він добре вивчений і в ньому можуть реплицироваться багато бактеріофаги і плазміди - потенційно корисні вектори. З поширенням генетичних маніпуляцій на клітини еукаріот і особливо з початком дослідження експресії генів в клітинах дріжджів, рослин і тварин з'явилася необхідність в розробці відповідних еукаріотичних систем господар-вектор.